פרופיל פנוטיפי של פנוטיפים התנהגותיים דמויי פרקינסון שנגרמו על ידי MPTP בזחלי דגי זברה בהתבסס על ניסוי התנהגותי

אנו מציגים פרוטוקול התנהגות רב-פרמטרי לפרופיל מקיף של פנוטיפים מוטוריים ולא-מוטוריים בפרקינסון זברה. פרוטוקול זה חל על מודלים של מחלת פרקינסון, סקר תרופות, נוירוטוקסיות סביבתית, מחקרים המשתמשים בזחלי הדגים. כדי להתחיל, כדאי ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן.

מדלל תמיסת E3 של 100x ביחס של 1 ל-100 עם מים אולטרה-טהורים להכנת חומר חוזק יחיד. כעת בחרו דגי זברה בוגרים זכרים ונקבות בוגרים מינית. באמצעות אקווריומי רבייה עם מחיצות נשלפות, בצע רבייה מבוקרת.

בשעה 20:00, מניחים דגי זברה זכרים ונקבות בחלקים נפרדים של אקווריום הרבייה ביחס של שני זכרים לשלוש נקבות, תוך שימוש במפרידים להפרדה ביניהם. למחרת בבוקר בשעה 8:00, הסירו את המחיצות כדי לאפשר הזדווגות. אסוף את העוברים שעה לאחר מכן ושוטף אותם שלוש פעמים עם מים נקיים במערכת.

מאחסנים את העוברים בצלחות פטרי 100 מ"מ המכילות 20 מיליליטר של מדיום E3 טרי. לאחר מכן דגרו את העוברים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במחזור אור של 14 שעות ומחזור חושך של 10 שעות. ביום אחד לאחר ההפריה, יש להסיר בזהירות עוברים לא מופריים, מעוותים ובלתי תקינים באמצעות פיפט מרעה.

שאפו את המדיום באיטיות מקצה צלחת הפטרי והוסיפו מדיום עובר E3 טרי לאורך דופן צלחת הפטרי כדי למזער הפרעה לעוברים מהסוג הפראי. לקבוצת ה-MPTP שטופלה, השתמשו בתמיסת MPTP של 50 מיקרומולר. ארבעה ימים לאחר ההפריה, שנו פיפטת מרעה בנפח 3 מיליליטר על ידי חיתוך של 10 מילימטרים מהקצה ליצירת קידוח רחב.

בשעה 18:00, השתמשו בפיפטה המותאמת כדי לבחור זחלי דגי זברה מכל קבוצה ולהעביר זחל אחד מכל באר לפלטת 96 בארות. צפו בכל באר תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שכל זחל דג זברה נראה בריא. ודאו שהסנפירים פתוחים ומתנדנדים באופן קבוע, הגוף זקוף, וסולם השחייה מנופח.

לאחר מכן, נקה בקפידה את תחתית הפלטה כדי למנוע מלכלוך להשפיע על תוצאות מעקב הווידאו. לאחר מכן העבר את לוח ה-96 בארות במרכז לתחתית תא תיבת הזברה. בחר במצב הקוונטיזציה בתוכנת מעקב הווידאו.

למעקב אחרי ויסות ערות שינה, הגדר את התאורה לכבות את האור ב-22:00 ולהדליק ב-8:00 בבוקר. הגדר את פרמטרי התוכנה כך שסף הגילוי יוגדר ל-40, פרץ ל-25, קפיא ל-4, זמן ניטור כולל ל-52 שעות, ואז ל-60 שניות. התחילו את תהליך השינה ב-8:00 PM.To לעקוב אחרי תגובות פוטו-מוטוריות, הניחו את הזחלים חמישה ימים לאחר ההפריה בצלחת 96 בארות עם זחל אחד בכל באר. לאחר מכן הגדר את תוכנית מעבר האור לאפס עד 60 שניות של חושך, ואחריה 60 עד 120 שניות של אור קבוע.

הפעל את הפרוטוקול ואספו פרמטרי תנועה כל שש שניות במהלך הבדיקה של 120 שניות. עצור את הפרוטוקול ב-120 שניות ויצא את קובץ הנתונים. לאחר מכן הניחו את הזחלים בחושך מוחלט למשך חמש דקות כדי להסתגלם לבדיקת אור האור החשוך הבא.

הגדר את תוכנית מעבר האור לספק אור מהבהב ב-10 הרץ למשך 60 שניות. להערכת תיגמוטקסיס, בחרו שני לוחות עם שישה בארות. מלאו כל באר בארבעה מיליליטר של E3 בינוני.

חמישה ימים לאחר ההפריה, אספו זחלי דגי זברה מקבוצת הסוג הבר ומקבוצת ה-MPTP המטופלת ומניחים אותם בשישה לוחות באר נפרדים. לפני הערכת התיגמוטקסיס, הניחו את לוחות הבאר בתיבת הזברה למשך 15 דקות כדי לאפשר הסתגלות. לאחר מכן השתמשו בפונקציית שטח המשיכה כדי לצייר שני מעגלים קונצנטריים בכל באר כאשר רדיוס המעגל הפנימי שווה לחצי מרדיוס הבאר, ולהתחיל להעריך.

להערכת תנועה, יש להעביר זחלי דגי זברה בני חמישה ימים מקבוצת הטיפוס הפראי ומקבוצת ה-MPTP המטופלת לשני לוחות נפרדים בני 12 בארות. לאחר הסתגלות של 15 דקות, בחרו במצב הניתוח המקוון למעקב והקלטו פעילות מנוע במשך חמש דקות באמצעות מערכת המעקב האוטומטית של הווידאו. למבחן תגובת ההבהלה, העבר זחלים בני חמישה ימים בנפרד לשני לוחות של 12 בארות עם זחל אחד בכל באר ושני מיליליטרים של E3 בינוני.

הניחו את הצלחות בקופסת הזברה לתקופת הסתגלות קלה של חמש דקות. הפעל את תוכנת ZebraLab והפעיל את מצב הניתוח המקוון של המעקב. פתח את ממשק הפעלת האור, ואז בחר, השתמש באחת משלוש שיטות ההפעלה למטה, ואפשר גירויים משופרים.

לאחר מכן, הגדר את שיטת ההתחלה לזמן תחילת הסשן. בלוח הזמנים של המעבר, הגדר את קצב ההבזק האפל. הגדר את התוכנית להפעלה אחרי 21 שניות, ואז הגדר מעבר מאחד עד חמש מילישניות בעוצמת אור של 100%.

מעבר שניים ל-2, 890 מילישניות בעוצמת אור של 100%. מעבר בין שלוש לחמש אלפיות שנייה עם 0% עוצמת אור, ומעבר בין ארבע ל-100 מילישניות עם 0% עוצמת אור. סמן את התיבה לרשימת המעברים החוזרת כדי להבטיח פלאשינג תקופתי, ואז התחל את הפרוטוקול.

לבדיקת האתגר של בהיר כהה, העבר את זחלי דג הזברה לשני לוחות של 24 בארות עם זחל אחד בכל באר ומיליליטר אחד של מדיום E3. אחרי חמש דקות הסתגלות בתיבת הזברה, הפעל את מצב ניתוח המעקב אונליין. לאחר מכן הגדר את תוכנית האור לשש דקות של אור קבוע, ואחריהן ארבע דקות של חושך מוחלט.

בדקה העשירית, עצור את הקלטת ההתנהגות ושמור את הנתונים. הסר בזהירות את הצלחת מקופסת הזברה. לאחר כל ניסוי התנהגותי, רססו ונגבו את כל המשטחים שנגעו ב-MPTP בתמיסת נתרן היפוכלוריט טרייה.

אספו פסולת נוזלית ומוצקה המכילה MPTP וסמנו בבירור כפסולת נוירוטוקסית מסוכנת. טפלו בכל החומרים המזוהמים בתמיסת נתרן היפוכלוריט טרייה. זחלי דגי זברה שטופלו הראו סימנים מופרעים בפעילות שינה וער בהשוואה לקבוצת הסוג הבר.

זמן השינה הכולל גם עלה משמעותית בקבוצה המטופלת. מספר הפעמים של חופשות שינה ירד באופן משמעותי בקבוצה המטופלת, בעוד שאורך השינה הממוצע גדל. פעילות הערות והפעילות הממוצעת נפגעו באופן משמעותי בקבוצה המטופלת.

באור קבוע, מדד הקיפאון של הקבוצה המטופלת עלה משמעותית. הוא גם עלה משמעותית תחת גירוי אור מהבהב ב-10 הרץ. עקומות תגובה פוטו-מוטוריות הראו ירידה בתגובתיות בקבוצה המטופלת.

תוצאות המעקב הצביעו על ירידה בהתנהגות מוטורית וחקרנית בקבוצה המטופלת. השחייה הכוללת ומהירות השחייה הממוצעת גם הם ירדו משמעותית בקבוצה המטופלת. יחס זמן התנועה בהקפאה היה גבוה משמעותית בקבוצה המטופלת, אך יחס זמן התנועה המהירה היה נמוך משמעותית.

מעברים מתחלפים בין אור לחושך יצרו שיאי מהירות בולטים בזחלים מסוג פראי. טווח השחייה לאחר הגירוי ומהירות השיא לאחר הגירוי ירדו משמעותית בקבוצה המטופלת. ההשהיה לתחילת תנועת מהירות השיא גם היא התעכבה משמעותית בקבוצה המטופלת.

האתגר המרכזי הוא מזעור הגורמים הפנימיים תוך התחשבות בשונות אישית, כדי להבטיח ניתוח התנהגותי מדויק וניתן לשחזור ברמת דגי הזברה. ניתן ליישם קיבוץ התנהגותי ופרופילינג פנומי כדי לחשוף השפעות נוירוטוקסיות עדינות ולקבל תובנות מגנטיות עמוקות יותר. מחקרים עתידיים יוכלו ליישם פלטפורמה זו לסינון תרופות מאושרות ולהערכה פרמקולוגית במודלים של מחלת פרקינסון דגי זברה.