הפקת חומצות שומן קצרות שרשרת מצואת עכברים באמצעות שיטת חומצה-ממס דו-פאזית
17 ביולי 2026
פרוטוקול זה מתאר שיטת חילוץ חומצה-ממס דו-פאזית לבידוד חומצות שומן קצרות שרשרת מדגימות צואה עכבריות בעלות קלט נמוך ללא גזירה.
פרוטוקול זה מאפשר חילוץ של חומצות שומן קצרות שרשרת או SCFAs מדגימות צואה עכבריות עם קלט נמוך לניתוח שגרתי מבוסס כרומטוגרפיה גזית. SCFAs כולל אצטט, פרופיונאט ובוטיראט מיוצרים על ידי מיקרוביום המעי באמצעות תסיסה של סיבים תזונתיים. הם נחקרים רבות כי הם קשורים לפנוטיפים התנהגותיים, מטבוליים ופיזיולוגיים.
עם זאת, כימות SCFAs בדגימות צואה נותר מאתגר. מטבוליטים אלו נדיפים, לעיתים קרובות נמצאים ברמות נמוכות, ונמדדים במטריצות ביולוגיות מורכבות. במחקרי עכברים, כמות הצואה שנאספת מכל בעל חיים לעיתים מוגבלת.
שיטות סטנדרטיות עשויות לדרוש גזירה, נפחי דגימות יחסית גדולים או ציוד מיוחד. כאן, מוצגת זרימת עבודה דו-פאזית של חילוץ ממס חומצה באמצעות חומצה הידרוכלורית מדוללת ואתיל אצטט, לצורך הפקת SCFAs מדגימות צואה עכבריות בעלות קלט נמוך, בפורמט התואם לניתוח GC שגרתי. אז נתחיל עם הפריסה הנכונה שלנו כדי להמשיך את שאר הפרוטוקול שלנו.
הבא יש לנו את קופסת הדגימה עם דגימות הצואה הקפואות שלנו מסומנות נכון. לאחר מכן, כוונו את הפיפטה של 1000 מיקרוליטר ל-255. עכשיו יש לנו את ה-HCl המסומן שלנו.
אנחנו ממשיכים להקצות HCl לכל אחת מהדגימות שלנו. עכשיו, אנחנו שמים אתנול לבאר הניקוי של הפינצטה שלנו. כיום, אנחנו משתמשים באותו אתנול כדי ליצור את האמבטיה שלנו לעלי.
עכשיו, אנחנו לוקחים דגימות צואה ומכניסים אותן לבקבוקי הצנטריפוגות. כיום, אנו משתמשים בעלי הניקוי שלנו כדי לטחון כל דגימת צואה בתוך בקבוקוני הצנטריפוגה המתאימים. אנחנו לוקחים דגימות ומניחים אותן על המערבולת לפחות 10 שניות או עד שהן מתערבבות לחלוטין.
אנחנו מביאים את הדגימות המעורבות לצנטריפוגה שלנו ומערכים. וודא איזון נכון של הצנטריפוגה. כוון את הצנטריפוגה ל-16,000 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר 10 דקות, הוציאו את הדגימות מהצנטריפוגה. תתייג מחדש בקבוקי צנטריפוגות חדשים התואמים לדגימות שלך. כוון את הפיפטה בנפח 200 מיקרוליטר ל-120.
הסר בזהירות את הסופרנטנט, וודא לא לגעת בכדור. העבר את הסופרנטנט לבקבוקונים החדשים שלך. אפשר להשליך את הכדור.
הוסיפו כמות שווה של אתיל אצטט לבקבוקים החדשים שלכם. תחזיר את הדגימות האלה לצנטריפוגה. כוון את הצנטריפוגה ל-2, 374 פעמים גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
אחרי 20 דקות, הסר את הדגימות. תתייג מחדש בקבוקי צנטריפוגות חדשים התואמים לדגימות שלך. החזר את הפיפטה ל-120 מיקרוליטר.
היזהר לא לגעת בשכבה התחתונה, להסיר רק את השכבה העליונה. העבר את הסופרנטנט לבקבוקונים חדשים עם תוויות נכונות. העבר את הדגימות לתיבת הדגימות שלך לאחסון עד לניתוח נוסף.
לבסוף, שים קופסת דגימה במקפיא מינוס של 80 מעלות צלזיוס. האליקוטים של SCFA שהופקו, 120 מיקרוליטר כל אחד, אוחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לפני הכימות באמצעות כרומטוגרפיית גז. ניתוח כמותי זיהה שמונה SCFAs, כולל מטבוליטים מרכזיים: חומצה אצטית, חומצה פרופיונית וחומצה בוטירית כפי שמוצג באיור.
כדי לאמת בידוד SCFA, הוערכו נתוני כרומטוגרפיית גז באמצעות בדיקות התאוששות ושחזור. ההתאוששות הוערכה על ידי דגימות בקרה עם ריכוזים ידועים של התקן הפנימי, בעוד ששחזוריות אושרה על ידי ניתוחים חוזרים בתוך ובמהלך ימים. לסיכום, פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה לחילוץ SCFA מדגימות צואה עכבריות בעלות קלט נמוך.
הוא אינו דורש גזירה והוא תואם לניתוח שגרתי מבוסס GC. שיטה זו יכולה לתמוך במדידת SCFA בצואה במודלים שונים של עכברים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול למיצוי חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) מדגימות צואה של עכברים בכמות נמוכה, תוך שימוש בשיטת מיצוי חומצה-ממס דו-פאזית. הגישה מותאמת לנפחי דגימות קטנים ותואמת לציוד מעבדה סטנדרטי, מה שמאפשר הכנה יעילה של דגימות לניתוח המבוסס על כרומטוגרפיה גזית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- כימיה אנליטית
- מטבולומיקה
- מחקר מיקרוביום
רקע
- חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) הן מטבוליטים מיקרוביאליים חשובים במעי בעלי תפקידים ביולוגיים משמעותיים.
- כימות מדויק של חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) מדגימות צואה קטנות מהווה אתגר במחקרים בבעלי חיים קטנים.
- שיטות מיצוי קיימות עשויות לדרוש נגזרת (derivatization) או כמויות דגימה גדולות.
- קיים צורך בפרוטוקולים סטנדרטיים ויעילים התואמים את זרימות העבודה האנליטיות השגרתיות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול למיצוי SCFAs מדגימות צואה בודדות של עכברים במשקל 20–50 mg.
- מתן אפשרות להפרדה בין פאזות ללא דריבטיזציה (נגזרות), באמצעות חומצה כלורית מדוללת ואתיל אצטט.
- הבטחת תאימות לניתוח המבוסס על כרומטוגרפיה של גזים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הומוגניזציה של צואה
- החמשה באמצעות חומצה כלורידית מדוללת
- חלוקה לממס אורגני באמצעות אתיל אצטט
- צנטריפוגציה בטמפרטורה נמוכה
- שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי
תוצאות עיקריות
- מיצוי מוצלח של חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) עיקריות (acetate, propionate, butyrate) מדגימות צואה בודדות של עכברים.
- רזולוציה ברורה של שיאי SCFA בזמני שהייה (retention times) אופייניים מעל רמת הרעשB.
- הפרוטוקול יעיל עבור דגימות בכמות קלט נמוכה ושומר על תאימות עם פלטפורמות שגרתיות של כרומטוגרפיה של גז.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק תהליך עבודה סטנדרטי להפקת SCFA מדגימות צואה מוגבלות.
- הוא נותן מענה לאתגרים פרוצדורליים במחקרים בבעלי חיים קטנים.
- השיטה תומכת בניתוח SCFA אמין בשלבים הבאים באמצעות ציוד מעבדה נפוץ.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיצוי סטנדרטי של חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) מדגימות צואה של עכברים בכמויות קלט נמוכות נותן מענה לבקבוק קריטי בתהליכי גילוי המונחים על ידי המיקרוביום ובמטבוליזום פרה-קליני. פרוטוקול זה מאפשר כימות מהימן של SCFAs באמצעות כרומטוגרפיית גזים שגרתית, ובכך הוא תומך במחקרים תרגומיים המקשרים בין מטבוליטים מיקרוביאליים במעי לבין הביולוגיה של המאכסן. השיטה משפרת את הביטחון החזוי בשלבי גילוי מוקדמים ומקלה על השוואה בין מחקרים עבור פורטפוליו R&D ארגוני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה חסונה של SCFAs ממקור מעי למחקר מיקרוביום מונחה-השערות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מסלולים מטבוליים מיקרוביאליים במודלים רלוונטיים למחלות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת קריאות כמותיות של מטבוליטים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין תמציות ביולוגיות סטנדרטיות התואמות את זרימות העבודה של כרומטוגרפיה גזית בסריקה גבוהה.
- משפר את השחזוריות של הבדיקה ואת היכולת להשוות בין דגימות פרה-קליניות בעלות כמות חומר נמוכה.
- מאפשר סריקה מהימנה של התערבויות המווסתות את ייצור ה-SCFA.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את כימות המטבוליטים לאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים במודלים של בעלי חיים קטנים.
- תומכת ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות המכוונות למיקרוביום.
- מפחיתה את הסיכון לשונות אנליטית במחקרים חוצי-ניסויים וחוצי-אתרים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול מיצוי זה מתאים לרצף שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקרים פרה-קליניים, ומאפשר ניתוח כמותי של SCFA מחומר ביולוגי מוגבל, תוך תמיכה במחקרי סמנים ביולוגיים ובחקר מנגנונים בהמשך התהליך.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת זרימת עבודה סטנדרטית לבדיקת השערות וחקירת מסלולים במחקר מיקרוביומה.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות ו可שחזרות של SCFA המתאימות לפיתוח בדיקות ולהערכת תרכובות.
- אנליזה: מייצרת פסגות כרומטוגרפיות ברורות לצורך ניתוח השוואתי של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקלה על התאמת נתוני מטבוליטים פרה-קליניים עם יעדי ביומרקרים תרגומיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע שיטת מיצוי בעלת יישום רחב למגוון מחקרים של מיקרוביומה ומטבולומיקה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בקשרי מיקרוביום-מטבוליט ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי מיצוי ואנליזה בין מחקרים, ובכך משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת תוכניות הממוקדות במיקרוביום ומפחית סיכון אנליטי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של נכסי גילוי מונעי מיקרוביום ומטבוליטים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהומוגניזציה של דגימות ובניתוח באמצעות כרומטוגרפיה של גזים.
- עושה שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי ובתשתית אנליטית שגרתית.
- דורש הקפדה של כל הצוותים על פרוטוקולים סטנדרטיים של מיצוי וניתוח.
- ניתן להתאמה למגוון מודלים של בעלי חיים קטנים ולכמויות דגימה מוגבלות.
- יש לתקף את יעילות המיצוי ואת מגבלות הגילוי עבור כל הקשר ניסיוני.
