Name: בידוד, טיפוח והעברה חולפת של תאי T ראשוניים אנושיים ליצירת תאי T של קולטני אנטיגן כימריים (CAR) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למדו פרוטוקול מקיף לבידוד, הפעלה והעברה חולפת של תאי T ראשוניים אנושיים ליצירת תאי CAR-T. השיטה מאפשרת הערכה מהירה של מבני קולטנים כימריים לטיפולים סלולריים מתקדמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Bartelt, R. R., Cruz-Orcutt, N., Collins, M., Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T+cell+receptor-induced+proximal+signaling+and+downstream+functions+in+immortalized+and+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of T cell receptor-induced proximal signaling and downstream functions in immortalized and primary T cells.</a> PLoS One. 4 (5), e5430(2009).</li>
<li>Smeets, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+profiling+of+T+lymphocyte+signal+transduction+pathways%3B+Th1+and+Th2+genomic+fingerprints+are+defined+by+TCR+and+CD28-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway profiling of T lymphocyte signal transduction pathways; Th1 and Th2 genomic fingerprints are defined by TCR and CD28-mediated signaling.</a> BMC Immunol. 13 (12), (2012).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jurkat+T-cell+lines+exhibit+marked+genomic+instability+affecting+karyotype%2C+mutational+profile%2C+gene+expression%2C+immunophenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Jurkat T-cell lines exhibit marked genomic instability affecting karyotype, mutational profile, gene expression, immunophenotype and function.</a> Sci Rep. 15 (1), 22426(2025).</li>
<li>Dobersberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineering+strategy+to+target+activated+EGFR+with+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells.</a> Cell Rep Methods. 4 (4), 100728(2024).</li>
<li>Van Bruggen, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+cells+impair+mitochondrial+fitness+in+CD8%2B+T+cells+and+impede+CAR+T-cell+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy.</a> Blood. 134 (1), 44-58 (2019).</li>
<li>Hoffmann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+expansion+potential+of+naive+chimeric+antigen+receptor+T+cells+from+healthy+donors+and+untreated+chronic+lymphocytic+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differences in expansion potential of naive chimeric antigen receptor T cells from healthy donors and untreated chronic lymphocytic leukemia patients.</a> Front Immunol. 8 (1956), (2017).</li>
<li>Zhang, D. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+CAR-T+cell+functionality+in+a+patient-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner.</a> Nat Commun. 14 (1), 506(2023).</li>
<li>Li, Y., Kurlander, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-CD3+and+anti-CD28-coated+beads+with+soluble+anti-CD3+for+expanding+human+T+cells%3A+differing+impact+on+CD8+T+cell+phenotype+and+responsiveness+to+restimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation.</a> J Transl Med. 8 (104), (2010).</li>
<li>Xu, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+comparative+analysis+reveals+differential+impacts+of+various+cytokines+on+CART+cell+phenotype+and+function+ex+vivo+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Multiparameter comparative analysis reveals differential impacts of various cytokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo.</a> Oncotarget. 7 (50), 82354-82368 (2016).</li>
<li>Cornish, G. H., Sinclair, L. V., Cantrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-cell+growth+by+IL-2+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15.</a> Blood. 108 (2), 600-608 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Foster, J. B., Barrett, D. M., Kariko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+in+vitro-transcribed+mRNA+in+adoptive+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">The emerging role of in vitro-transcribed mRNA in adoptive T cell immunotherapy.</a> Mol Ther. 27 (4), 747-756 (2019).</li>
<li>Becker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+effectiveness+of+gammadelta+T+cells+by+mRNA+transfection+of+chimeric+antigen+receptors+or+bispecific+T+cell+engagers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Enhancing the effectiveness of gammadelta T cells by mRNA transfection of chimeric antigen receptors or bispecific T cell engagers.</a> Mol Ther Oncolytics. 29, 145-157 (2023).</li>
<li>Wiesinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-scale+production+of+CAR-T+cells+for+the+treatment+of+melanoma+patients+by+mRNA+transfection+of+a+CSPG4-specific+CAR+under+full+GMP+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Clinical-scale production of CAR-T cells for the treatment of melanoma patients by mRNA transfection of a CSPG4-specific CAR under full GMP compliance.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1198(2019).</li>
<li>Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+meets+mRNA+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology.</a> Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).</li>
<li>Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-based+therapeutics--developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 759-780 (2014).</li>
<li>Underwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activators+exhibit+distinct+downstream+effects+on+chimeric+antigen+receptor+T+cell+phenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohorizons%22%5BJournal%5D)">T cell activators exhibit distinct downstream effects on chimeric antigen receptor T cell phenotype and function.</a> Immunohorizons. 8 (6), 404-414 (2024).</li>
<li>Zajc, C. U., Teufl, M., Traxlmayr, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+stability+analysis+of+yeast+displayed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity and stability analysis of yeast displayed proteins.</a> Methods Mol Biol. 2491, 155-173 (2022).</li>
<li>Seigner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+mystery+of+the+FMC63-CD19+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Solving the mystery of the FMC63-CD19 affinity.</a> Sci Rep. 13 (1), 23024(2023).</li>
<li>Jalkanen, A. L., Coleman, S. J., Wilusz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+and+implications+of+mRNA+poly%28A%29+tail+size--does+this+protein+make+my+tail+look+big%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Determinants and implications of mRNA poly(A) tail size--does this protein make my tail look big.</a> Semin Cell Dev Biol. 34, 24-32 (2014).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+encoding+a+chimeric+antigen+receptor+is+critical+for+the+generation+of+a+robust+T-Cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA encoding a chimeric antigen receptor is critical for the generation of a robust T-Cell response.</a> Hum Gene Ther. 30 (2), 168-178 (2019).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-mRNA+for+transient+CAR+T+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimal chimeric antigen receptor (CAR)-mRNA for transient CAR T cell generation.</a> Int J Mol Sci. 26 (3), 965(2025).</li>
<li>Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+assays+to+measure+CAR+T-cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+approach+to+generate+transient+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+mRNA+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A nonviral approach to generate transient chimeric antigen receptor T cells using mRNA for cancer immunotherapy.</a> J Vis Exp. (216), e67548(2025).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+mRNA+CAR+T+cells+targeting+GD2+provide+dose-adjusted+efficacy+against+diffuse+midline+glioma+and+high+grade+glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Transient mRNA CAR T cells targeting GD2 provide dose-adjusted efficacy against diffuse midline glioma and high grade glioma models.</a> Neuro Oncol. 27 (10), 2684-2696 (2025).</li>
<li>Usheva, Z. I., Petersen, D. L., Barington, T., Mouritzen, P., Barnkob, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+cytotoxicity+assay+to+assess+chimeric+antigen+receptor+T+cells+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Droplet-based cytotoxicity assay to assess chimeric antigen receptor T cells at the single-cell level.</a> J Vis Exp. (217), e67657(2025).</li>
<li>Subham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+cytotoxicity+evaluation+of+Jurkat+expressing+chimeric+antigen+receptor+using+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro cytotoxicity evaluation of Jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging.</a> J Vis Exp. (200), e65560(2023).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+primary+human+and+mouse+T+lymphocytes+using+RNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation.</a> Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Clausen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+the+activation-associated+receptors+CD25+and+CD69+on+human+NK-cells+and+NK-like+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells.</a> Immunobiology. 207 (2), 85-93 (2003).</li>
<li>Poloni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation-induced+marker+assays+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell activation-induced marker assays in health and disease.</a> Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).</li>
<li>Rotta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+flow+cytometry+immunophenotyping+of+human+antigen-specific+T+cells+by+activation-induced+marker+and+Th1+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for flow cytometry immunophenotyping of human antigen-specific T cells by activation-induced marker and Th1 cytokine detection.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103343(2025).</li>
<li>Elsallab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+primary+malignancies+after+commercial+CAR+T-cell+therapy%3A+analysis+of+the+FDA+adverse+events+reporting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Second primary malignancies after commercial CAR T-cell therapy: analysis of the FDA adverse events reporting system.</a> Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).</li>
<li>Verdun, N., Marks, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+cancers+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Secondary cancers after chimeric antigen receptor T-cell therapy.</a> N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).</li>
<li>Krug, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+activity+of+MCSP-specific+chimeric+antigen+receptors+%28CARs%29+depend+on+the+scFv+antigen-binding+domain+and+the+protein+backbone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Stability and activity of MCSP-specific chimeric antigen receptors (CARs) depend on the scFv antigen-binding domain and the protein backbone.</a> Cancer Immunol Immunother. 64 (12), 1623-1635 (2015).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+outperform+electroporation+in+mRNA-based+CAR+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles outperform electroporation in mRNA-based CAR T cell engineering.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101139(2023).</li>
<li>Sauerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mRNA+as+a+universal+technology+platform+to+transfect+a+variety+of+primary+cells+with+antigens+and+functional+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mRNA as a universal technology platform to transfect a variety of primary cells with antigens and functional proteins.</a> Methods Mol Biol. 2786, 219-235 (2024).</li>
<li>Bimbo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-specific+non-viral+DNA+delivery+and+in+vivo+CAR-T+generation+using+targeted+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell-specific non-viral DNA delivery and in vivo CAR-T generation using targeted lipid nanoparticles.</a> J Immunother Cancer. 13 (7), (2025).</li>
<li>Hudecek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+non-viral%3A+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+breaks+on+through+to+the+clinical+side%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).</li>
<li>Prommersberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircles+for+CAR+T+cell+production+by+sleeping+beauty+transposition%3A+a+technological+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Minicircles for CAR T cell production by sleeping beauty transposition: a technological overview.</a> Methods Mol Biol. 2521, 25-39 (2022).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum Mol Genet. 20 (R1), R14-R20 (2011).</li>
<li>Soundara Rajan, T., Gugliandolo, A., Bramanti, P., Mazzon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-Transcribed+mRNA+chimeric+antigen+receptor+T+cell+%28IVT+mRNA+CAR+T%29+therapy+in+hematologic+and+solid+tumor+management%3A+A+preclinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro-Transcribed mRNA chimeric antigen receptor T cell (IVT mRNA CAR T) therapy in hematologic and solid tumor management: A preclinical update.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).</li>
<li>Granit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+activity+of+autologous+RNA+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+in+myasthenia+gravis+%28MG-001%29%3A+a+prospective%2C+multicentre%2C+open-label%2C+non-randomised+phase+1b%2F2a+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study.</a> Lancet Neurol. 22 (7), 578-590 (2023).</li>
<li>Dagher, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+efficacy+of+multi-targeting+mRNA-based+CAR+T+cell+therapy+in+resection+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Preclinical efficacy of multi-targeting mRNA-based CAR T cell therapy in resection models of glioblastoma.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 36 (3), 102676(2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes, High Performance</td><td>VWR</td><td>525-1164</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates, flat bottom, TC-treated</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD staining solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-568</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag DYKDDDDK Antibody, APC, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-119-584</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Clinical Flow Cytometry System</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Merck</td><td>A4503-10G</td><td>לבידוד זרימה בכבידה</td></tr><tr><td>CD134 (OX40) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-048</td><td>חומר צביעה: PE</td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-764</td><td>חומר צביעה: APC</td></tr><tr><td>CD154 (CD40L) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-142</td><td>חומר צביעה: PerCP-VIO 700</td></tr><tr><td>CD25 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-541</td><td>חומר צביעה: PE-Vio 770</td></tr><tr><td>CD3 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-352</td><td>חומר צביעה: PE-Vio 670</td></tr><tr><td>CD4 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-223</td><td>חומר צביעה: APC-Vio 770</td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>לבידוד זרימה בכבידה</td></tr><tr><td>CD45 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-775</td><td>חומר צביעה: VioBlue</td></tr><tr><td>CD45RA Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-270</td><td>חומר צביעה: Vio Bright V600</td></tr><tr><td>CD62L Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-499</td><td>חומר צביעה: Vio Bright R720</td></tr><tr><td>CD69 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-800</td><td>חומר צביעה: VioGreen</td></tr><tr><td>CD8 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-677</td><td>חומר צביעה: FITC</td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td>לבידוד זרימה בכבידה</td></tr><tr><td>Cellstar 96 Well Suspension Culture Plate, U-bottom</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650 185</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810&nbsp;R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator ICO150</td><td>Memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>CoolNat Ice Machine</td><td>Ziegra Eismaschinen GmbH</td><td>ZBE 30-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning CoolCell Freezer Container</td><td>Corning</td><td>CLS432000</td><td></td></tr><tr><td>Counting chamber, Bürker-Türk pattern, BLAUBRAND</td><td>Brand</td><td>719520</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure tubes, 2 mL, QuickSeal screw cap</td><td>Sarstedt</td><td>72,380</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX LX Flow Cytometer</td><td>Beckmann Coulter</td><td>C11185</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) Cell culture grade</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes with 4 mm gap size, yellow cap</td><td>VWR</td><td>732-1137</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 0.1&ndash;2.5 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 100&ndash;1000 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 2&ndash;20 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 20&ndash;200 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Merck</td><td>E6758-100G</td><td>לבידוד זרימה בכבידה</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>325098</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Value FBS</td><td>Gibco</td><td>A52567-01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375-10G</td><td>לבידוד מדרגי צפיפות</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Sterile Graduated Transfer Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13469108</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>עם מודול PC ומודול CE</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with tailing)</td><td>New England Biolabs</td><td>E2060S</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-15, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-955</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-7, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-367</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&nbsp;PIPETBOY acu 2 pipet aid</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0085685</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>לבידוד זרימה ב

בידוד, טיפוח והעברה חולפת של תאי t ראשוניים אנושיים ליצירת תאי t של קולטני אנטיגן כימריים (car)

Isolation, Cultivation, and Transient Transfection of Primary Human T Cells to Generate Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells

הפעלה והתרחבות של תאי T ראשוניים בבני אדם תאי T ראשוניים הופסמו והופעלו ביום 0 עם חרוזי CD3/28 או TransAct, הורחבו במשך 23 ימים ונספרו כל 2-3 ימים (איור 2A). בימי הספירה, צפיפויות התאים הותאמו ל-0.3-0.5 x 106 תאים למ"ל. בימים 0/2/5/9/14/20, תאי T שימשו לניתוח זרימה ציטומטרית להערכת הפנוטיפ והביטוי של סמני הפעלה. בשבוע הראשון לאחר ההפעלה, תאי T התרבו והתרחבו במהירות עם שני מגיבי ההפעלה (איור 2B), עם התרחבות קיפול מעט נמוכה יותר בימים הבאים עבור תאי T שהופעלו על ידי TransAct (איור 2C). ראוי לציין כי הפעלת תאי T הייתה נראית גם בניתוח מיקרוסקופי, כאשר אשכולות תאי T נוצרו סביב מגבי ההפעלה (איור 2D).
<img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
איור 2: הפעלה והתרחבות של תאי T ראשוניים באמצעות שני מגיבים שונים להפעלה. (א) ייצוג סכמטי של ציר הזמן הניסוי. התאים הופעלו או עם חרוזי CD3/28 או TransAct ביום 0 ונתרבו במשך 23 ימים. נקודות כחולות מציגות ימים שבהם נספרו התאים, נקודות אדומות מציגות ימים שבהם התאים נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה, ונקודות סגולות מציגות ימים שבהם בוצעו שני הניתוחים. (B) ו-(C) התרחבות תאי T ראשוניים במהלך (B) השבוע הראשון או (C) בתוך 16 ימים מהתרבית. הערכים מציגים את סטיית התקן הממוצעת ± של 4 (חרוזי CD3/28) או 3 (TransAct) תורמי תאי T בריאים שונים. (D) תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של תאי T מופעלים עם התקבצות תאי גלוי בימים 1 ו-2 לאחר ההפעלה. התמונות צולמו במיקרוסקופ הפוך. הסרגל מתאים ל-200 מיקרון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הצורה.</a>
צביעת פנוטיפ וסמני הפעלה של תאי T לניתוח ציטומטרי זרימה, יושמה אסטרטגיית השער הבאה (איור 3): הוחל שער ראשון (גובה FSC לעומת גובה SSC) להסרת שאריות תאים וחרוזים, ואחריו שער לתאים בודדים (רוחב FSC לעומת שטח SSC). אחוז תאי CD3+ צריך להיות בטווח של 98-100%. תת-שער נוסף הניב אחוז של תאי T מסוג CD4+ (עוזר) ותאי T של CD8+ (ציטוטוקסיק), אשר הוגדרו עוד יותר לתת-קבוצות פנוטיפיות שונות של תאי T באמצעות הסמנים CD45RA ו-CD62L. תאי T של CD3+ נותחו בנוסף לביטוי סמנים של הפעלה (CD25/CD69/CD134/CD137/CD154).
<img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
איור 3: אסטרטגיית גייטינג לניתוח ציטומטרי זרימה. מוצגים גרפים מייצגים של תורם תאי T אחד שהופעל עם חרוזי CD3/28 ביום החמישי (n = 4). קיצורים; TEMRA = תאי זיכרון אפקטור T המבטאים מחדש CD45RA; TSCM = תאי T זיכרון דמויי תאי גזע; TEM = תאי T של זיכרון אפקטור; TCM = תאי T מרכזיים בזיכרון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>
לאחר הפעלה עם חרוזי CD3/28, אחוז תאי ה-T של CD4+ לעומת תאי CD8+ T ירד עם הזמן, כאשר 74.3% (± 7.4%) מתאי CD4+ T ביום החמישי, שירד ל-14.6% (± 3.4%) ביום ה-20 לאחר ההפעלה. תאי T של CD8+ עלו מ-20.7% (± 6.4%) ביום החמישי ל-82.4% (± 3.1%) ביום ה-20 (איור 4A). מגמות דומות זוהו לאחר ההפעלה עם TransAct, עם אחוזים מעט נמוכים יותר של תאי CD8+ T ביום ה-20 (72.5% ± 0.7%). לכן, ההתרחבות האיטית מעט של תאי T שנצפתה לאחר הפעלה עם TransAct התאימה לאחוז נמוך יותר של CD8+ ולאחוז גבוה יותר של תאי CD4+ במהלך תקופת ההתרחבות. ההבדלים בהרכב הפנוטיפי של תאי T היו דומים בשני המגבים האקטיבציונליים (איור 4B). עם זאת, תדירות תאי הזיכרון של אפקטור T שהביעו מחדש CD45RA (TEMRA) הייתה גבוהה יותר באופן כללי עבור תאי CD8+ מאשר בתאי CD4+ . בהתאם לכך, תאי T מסוג CD4+ הראו אחוזים גבוהים יותר של תאי זיכרון מרכזיים (TCM) ותאי זיכרון T דמויי תאי גזע (TSCM) (איור 4B).
CD134 היה סמן ההפעלה היחיד שכבר עבר ויסות לאחר הפשרת תאי T, כאשר 37.6% (± 4.1%) תאי T של CD134+ הופעלו עם חרוזי CD3/28 ו-36.1% (±4.4%) תאי T של CD134+ לתאי T מופעלים על ידי TransAct (איור 4C). בשתי אסטרטגיות ההפעלה, CD25, CD69 ו-CD134 היו מוגברים מאוד ביום השני. עבור חרוזי CD3/28, ביטוי CD69 ו-CD134 הגיע לשיא ביום ה-2, בעוד ש-CD25 הגיע לשיא ביום החמישי. תוצאות דומות נצפו עבור תאי T המופעלים על ידי TransAct. CD134 ו-CD154 עברו ויסות גבוה רק ביום ה-14 עבור חרוזי CD3/28 ותאי TransAct. בסך הכל, המגמות שנצפו היו דומות מאוד בין שני המגבים להפעלה. עם זאת, ביטוי CD69 ביום ה-14 היה מעט גבוה יותר בתאי T מופעלים על ידי CD3/28 לעומת מקביליהם ב-TransAct (97.1% ± 0.9% לעומת 86.5% ± 5.1%). זה תואם לקצב ההתרחבות הגבוה הממושך שנראה בתאי CD3/28 המופעלים על ידי חרוזים. לסיכום, פאנל סימני ההפעלה המוצע כולל סמנים שמועתקים הן בנקודות זמן מוקדמות והן מאוחרות לאחר ההפעלה, עם רגישות משתנה בין סמני ההפעלה השונים, אך באופן כללי, מגמות דומות לשני המגבים ההפעלה.
<img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
איור 4: ניתוח פנוטיפ של תאי T וביטוי סמן הפעלה עם תגובות הפעלה שונות במהלך תקופת טיפוח של 20 יום. (א) אחוזים של תאי T של CD4+/CD8+ במהלך גידול לאחר ההפעלה עם חרוזי CD3/28 (משמאל) או TransAct (מימין). (B) התמיינות תאי T לאחר הפעלה עם חרוזי CD3/28 (שני פאנלים שמאליים) או TransAct (שני פאנלים ימניים), כל אחד לתאי CD4+ או CD8+. הפנוטיפ הוערך באמצעות הסמנים CD45RA ו-CD62L. TEMRA: CD45RA+ CD62L-, TEM: CD45RA- CD62L-, TCM: CD45RA-CD62L+, TSCM: CD45RA+ CD62L+. (ג) ביטוי סימני הפעלה לאחר הפעלה עם חרוזי CD3/28 או TransAct ובמהלך תקופת ההתרחבות. תדירויות [%] של תאי ה-T של CD3+ בקבוצת המשפחה מוצגת (סטיית תקן ממוצעת ±של 4 [חרוזי CD3/28] או 3 תורמי תאי T בריאים שונים [TransAct]). קיצורים; TEMRA = תאי זיכרון אפקטור T המבטאים מחדש CD45RA; TSCM = תאי T זיכרון דמויי תאי גזע; TEM = תאי T של זיכרון אפקטור; TCM = תאי T מרכזיים בזיכרון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>
טרנספקציה זמנית של תאי T ראשוניים וניתוח ביטוי CAR תאי T ראשוניים הועברו ל-mRNA באמצעות אלקטרופורציה ביום השביעי לאחר ההפעלה עם חרוזי CD3/28 או TransAct. כתבנית, נעשה שימוש בקידוד mRNA לדור השני של CAR המיועד לכונדרויטין סולפט פרוטאוגליקן 4 (CSPG4) עם קו-גירוי CD28 ותחום איתות CD3ζ. תג DYKDDDDK (תג דגל) נכלל כדי לאפשר זיהוי זרימה-ציטומטרי. הערכות תאי T והביטוי של CAR הוערכו 3, 6, 24 ו-48 שעות לאחר האלקטרופורציה. הצביעה בוצעה כפי שמתואר בסעיף 6 של הפרוטוקול.
למרות שהכדאיות של תאי T מסוג חרוז CD3/28 ותאי T מופעלים על ידי TransAct הייתה נמוכה 3 שעות לאחר האלקטרופורציה, בסך הכל, החיוניות של תאי CAR T שעברו טרנספקציה נעה בין 51-85% ולא הייתה שונה משמעותית בין שתי אסטרטגיות ההפעלה (איור 5A). ה-CAR היה ניתן לזיהוי כבר בשלב מוקדם זה לאחר האלקטרופורציה. למרות שאחוז תאי CAR+ ירד בהדרגה עם הזמן, התדירות הגבוהה ביותר של תאי CAR+ הייתה ניתנת לזיהוי תוך 24 שעות לאחר האלקטרופורציה (איור 5B, לוח שמאל). ראוי לציין כי עוצמת האות הייתה יציבה בתוך 6 השעות הראשונות לאחר האלקטרופורציה וירדה בהדרגה לאחר מכן (איור 5B, לוח ימין). ביטוי CAR כמעט נעדר לאחר 48 שעות, מה שהדגים את האופי החולף של מניפולציה של תאים ואת חשיבות בחירת חלון זמן מוקדם לבדיקות במורד הזרם. גרפים נקודתיים מייצגים לביטוי CAR של תורם אחד מוצגים באיור 5C. עבור שני המגיבים להפעלה, יחס CD4/CD8 לא היה שונה בין תאים CAR לתאים שעברו טרנספקציה MOCK (איור 5D). בהתאם לתוצאות הקודמות, תאי T שהופעלו עם חרוזי CD3/28 הראו שכיחות מעט גבוהה יותר של תאי T ב-CD8+ מאשר תאים שהופעלו באמצעות TransAct. לניתוח הפנוטיפי, מוצג תורם מייצג אחד בשל וריאציות גדולות התלויות-תורם (איור 5E). בעוד שגם תגובת ההפעלה וגם מצב CD4/CD8 משפיעים על הפנוטיפ של תאי T, ביטוי CAR אינו גורם לשינוי בפנוטיפ בהשוואה לתאים שעברו טרנספקט MOCK.
כדי להעריך את השפעת ריכוז ה-mRNA על רמות הביטוי, תאי T ראשוניים עברו העברה עם mRNA מקודד לגרסה מוטנטית של GFP (muGFP) באמצעות 0.1, 0.3, 1, 3 או 6 מיקרוגרם של mRNA. אות ה-GFP נמדד באמצעות ציטומטריית זרימה 24 שעות לאחר האלקטרופורציה. כצפוי, כבר כמויות נמוכות של mRNA כמו 0.1 מיקרוגרם הובילו לאות GFP שניתן לזיהוי, עם עלייה הדרגתית בעוצמת האות עם עלייה בכמויות ה-mRNA. בניסויים שלנו, 1 מיקרוגרם mRNA כבר היה רווי, וכמויות גדולות יותר (3 ו-6 מיקרוגרם mRNA) לא הובילו לאות GFP מוגבר (איור 5F). דבר זה מדגיש את האפשרות להשתמש בכמויות משתנות של mRNA כדי לאזן את רמות הביטוי, מה שיכול להיות מועיל לבדיקת השפעה של רמות ביטוי אנטיגן שונות של CAR או אפילו מטרה28.
<img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
איור 5: קינטיקת ביטוי של CARs וניתוח פנוטיפ של תאי CAR T שעברו טרנספקט. (א) חיוניות של תאי CAR T לאחר אלקטרופורציה עם mRNA מקודד CAR. 2 מיקרוליטר 7-AAD ב-100 מיקרוליטר של בופר צביעה שימשו להערכת היתכנות לאחר 10 דקות דגירות. n = 2-3 תורמים בודדים (B) צביעה לביטוי CAR בנוגדן אנטי-DYKDDDDK (מצורף עם APC, דילול סופי של 1:50). לאחר שגייטינג על תאים ברי קיימא, נותחו או אחוז התאים החיוביים ל-CAR ביחס לבקרות שעברו MOCK-transfect (פאנל שמאל) או את עוצמת הפלואורסצנציה הגיאומטרית החציונית (GeoMean, הפאנל הימני) של כל האוכלוסייה. מוצגים ממוצעים של n = 3 תורמים בודדים ± S.D. (C) גרפים מייצגים של תורם אחד מ-(B) המדגימים את הקינטיקה של ביטוי CAR לאורך זמן. (ד) ניתוח תאי T מסוג CD4+/CD8+ והשוואה בין תאי T שעברו טרנספקציה MOCK לתאי T שעברו טרנספקציה ב-CAR, ושתי אסטרטגיות הפעלה שונות 24 שעות לאחר האלקטרופורציה. מוצגים ממוצעים של n = 3 תורמים בודדים ± S.D. (E) ניתוח פנוטיפי של תאי T שעברו MOCK-transfect ו-CAR, שהוצג ב-(B) 24 שעות לאחר האלקטרופורציה. מוצג תורם מייצג אחד של n = 3. (ו) ניתוח ביטוי muGFP 24 שעות לאחר אלקטרופורציה עם כמויות שונות של mRNA. גייטינג לתאים חיים בוצע לפני ש-GeoMean עבור GFP נמדד. מוצגים ממוצעים של n = 3 תורמים ± קיצורי S.D. CAR = קולטן אנטיגן כימרי; mRNA = חומצה ריבונוקלאית שליחה; 7-AAD = 7-אמינואקטינומיצין; RT = טמפרטורת החדר; muGFP = חלבון זוהר ירוק מוטנטי; S.D. = סטיית תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>

בידוד, טיפוח והעברה חולפת של תאי T ראשוניים אנושיים ליצירת תאי T של קולטני אנטיגן כימריים (CAR)

To assess the efficacy and potency of chimeric antigen receptor (CAR) T cells, it is essential to isolate, activate, expand, characterize, and genetically ...

isolation-cultivation-transient-transfection-primary-human-t-cells-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקה לייצור קולטן אנטיגן כימרי (CAR) תאי T ex vivo. תאי T אנושיים מודגרים בחרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD3 ונגד CD28, יחד עם מדיום בתוספת אינטרלוקין-2 (IL-2), המוביל להפעלה ושגשוג של תאי T. מוצגים וקטורים לנטי-ויראליים טרנסגניים, המאפשרים לרנ"א המהונדס להשתלב בגנום המארח ולבטא את הטרנסגן. התוצאה היא שתאי T המומרים מבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) על פני השטח שלהם. תאי T נקצרים בנקודות זמן מוגדרות כדי להעריך ביטוי CAR ושימור בהקפאה.

טכניקת Ex Vivo לייצור תאי T קולטני אנטיגן כימריים

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת תאי T מסוג קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לגידול (CAR). וקטורים רטרו-ויראליים הנושאים RNA מהונדס מעורבבים עם תאי טחול בתווך בתוספת אינטרלוקין-2 כדי לקדם הישרדות ושגשוג של תאי T. לאחר מכן התערובת מועברת לצלחת המצופה במקטעי פיברונקטין אנושיים רקומביננטיים וצנטריפוגה כדי להקל על איחוי הנגיף עם התא, מה שמאפשר לרנ"א להשתלב בגנום המארח ולייצר מכוניות הקשורות לפני השטח המכוונות לאנטיגן הגידול.

טכניקת Ex Vivo ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ספציפיים לגידול

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת תאי T של קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לאנטיגן (CAR) באמצעות התמרה רטרו-ויראלית. תאי מורין CD8+ T פעילים מתווספים לצלחת מיקרווול המצופה בשברי פיברונקטין רקומביננטיים. לאחר מכן מוצגים וקטורים רטרו-ויראליים המכילים RNA מהונדס המקודד קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לאנטיגן (CAR), והלוחית עוברת צנטריפוגה כדי להקל על הטרנסדוקציה. לאחר הדגירה, התאים המומרים מבטאים CARs ספציפיים לאנטיגן על פני השטח שלהם.

טכניקה ליצירת תאי CAR T ספציפיים לאנטיגן

אנו מתארים גישה מהימנה ליצור הקולטן אנטיגן הצ (רכב) T תאים ולבדוק בידול שלהם ותפקוד מבחנה בvivo.

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת

מאמר זה מפרט את תהליך הייצור של תאי T קולטני אנטיגן כימריים לשימוש קליני, במיוחד באמצעות מעבד תאים אוטומטי המסוגל לבצע התמרה נגיפית וטיפוח של תאי T. אנו מספקים המלצות ומתארים מלכודות שיש לקחת בחשבון במהלך תהליך הפיתוח והיישום של ניסוי קליני בשלב מוקדם.

ייצור תאי T של קולטן אנטיגן כימרי על מעבד תאים אוטומטי

פרוטוקול זה מייעל את הייצור הווקטורי הרטרו-ויראלי ואת התמרת תאי T מורין, ומאפשר ייצור יעיל של תאי CAR-T בעכבר.

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה ליצירה ובדיקה של תאי T רגולטוריים של קולטני אנטיגן כימריים אנושיים (CAR Tregs).

יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים (CAR) באמצעות mRNA לא משולב לאימונותרפיה לסרטן ומספק שיטות אמינות להערכת תאי CAR-T ותפקודם ציטוטוקסי.

גישה לא ויראלית ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים באמצעות mRNA לאימונותרפיה לסרטן

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת טיפות תחליב כפולות המכילות תא T אחד ותא מטרה סרטני כדי לבחון הרג תאים ברמת התא הבודד. שיטה זו מאפשרת כימות כפול הן של מולקולות ציטוטוקסיות והן של אפופטוזיס של תאי מטרה בתוך אוכלוסייה גדולה של תאי T.

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

פרוטוקול מפורט מסופק לשימוש בטכנולוגיית CRISPR/Cas9 כדי להשיג דפיקה ממוקדת יעילה ביותר של מבנים גדולים ומולטי-ציסטרוניים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות מסלול תיקון ה-DNA בתיווך הומולוגיה (HMEJ). תאי T המהונדסים עם פרוטוקול זה הניתן להתאמה ל-cGMP שומרים על התרחבות תאים מצוינת, ציטוטוקסיות וייצור ציטוקינים.

הנדסה לא ויראלית של תאי T אנושיים ראשוניים באמצעות אינטגרציה ממוקדת בתיווך הומולוגיה של תבניות DNA גדולות

למדו פרוטוקול מקיף לבידוד, הפעלה והעברה חולפת של תאי T ראשוניים אנושיים ליצירת תאי CAR-T. השיטה מאפשרת הערכה מהירה של מבני קולטנים כימריים לטיפולים סלולריים מתקדמים.

בידוד, טיפוח והעברה חולפת של תאי T ראשוניים אנושיים ליצירת תאי T של קולטני אנטיגן כימריים (CAR)

גלה סרטונים נוספים