תהליך עבודה של טומוגרפיית קריו-אלקטרון לרקמות עבות שהודגם בהיפוקמפוס של עכבר
27 במרץ 2026
פרוטוקול זה מתקן את טומוגרפיית הקריו-אלקטרון (קריו-ET) לרקמות עבות על ידי שילוב הקפאה בלחץ גבוה (HPF) עם שיטת הוופל, הרמת קרן יוני מוקד קריוגנית (crio-FIB), ורכישה מקבילה סימטרית במינון, מה שמניב למלות דקות ודגימות מזגוגות לניתוח שכפול בשטח בהיפוקמפוס העכבר.
המחקר שלי מתמקד בהקמת תהליך קריו-ET סטנדרטי שיאפשר ניתוח מבני במקום של רקמות עבות כמו היפוקמפוס העכבר. שיטות קיימות חסרות אמינות לרקמות עבות, ולכן פרוטוקול זה משלב שלבים אופטימליים לניתוח סטנדרטי. כדי להתחיל, הנח טיפה של 10 ליטר עם תמיסת סוכרוז 10% על משטח זכוכית נקי.
נתח במהירות את ההיפוקמפוס מעכבר שזה עתה הורד. באמצעות להב גילוח חד, יש להסיר חתיכות רקמה קטנות בנפח 0.5 עד 1 מילימטרים מעוקבים. באמצעות קיסם או מברשת דקה, העבר את הרקמה לרשתות התמיכה הנחושת TEM המוכנות בתוך נושא ההקפאה בלחץ גבוה.
השתמש ב-2-מתילפנטאן כדי לשמור על הרקמה לחה ולהתאים את מיקומה על הרשת, תוך הפחתת עומס מכני כדי למנוע נזק לרשת. לאחר מכן, כסו את הרקמה והרשת בדיסק אלומיניום בקוטר 3 מילימטר. להשלמת ההרכבה, מניחים את נושא ההקפאה השני בלחץ גבוה, שטוח כלפי מטה, למעלה ליצירת כריך וופל אטום.
ובדוק את פרמטרי ההקפאה כדי לוודא שאין חריגות בכלי. ודא שהזמן הכולל מניתוח הרקמות ועד ההקפאה לא יעלה על 90 שניות. השגת רשת זהב חדשה עם 300 רשתות שתשמש כרשת המקלט הסופית להליך ההרמה.
מתחת למיקרוסקופ סטריאו בטמפרטורת החדר, חבר בעדינות את הרשת לטבעת AutoGrid תואמת ל-cryo-FIB. לאחר מכן, יש לאחסן את ה-AutoGrid המורכב ישירות בתנור יבש, בטמפרטורה של כ-40 מעלות צלזיוס, כדי למזער הצטברות כפור לפני השימוש. בזמן טבילה רציפה של ההרכבה בחנקן נוזלי, יש להפריד בזהירות את רשת ה-TEM המזגוגת מרכיבי הרכבת הוופל הסובבים.
באמצעות פינצטה עם קצה דק מקורר מראש, הפרדו בעדינות את שני נושאי ההקפאה בלחץ גבוה. לאחר מכן, בתחנת עבודה מקוררת מראש, התקן את רשת הרקמה המבודדת בתוך טבעת AutoGrid שנייה של קריו-FIB תחת הגנה של חנקן נוזלי. טען את שני ה-AutoGrid לחריצים המיועדים של מחזיק הדגימה של מעבורת ההקפאה.
כוון כל AutoGrid כך שחריץ המילינג פונה החוצה וממוקם אנכית כדי לאפשר זווית מילינג נמוכה יותר. השאירו את השאטל הטעון במלואו טבול בחנקן נוזלי או נשמר במצב מקורר מראש עד להעברה ל-FIB-SEM. טעין את שלב הדגימה לתוך הכלי באמצעות מוט הדגימה.
לאחר העברה קריוג'ית למיקרוסקופ, יש לנווט לרשת הרקמה בהגדלת SEM נמוכה. לאחר מכן, ציפוי פלטינה על פני הרשת בפלטינה בעוצמה של 30 מיליאמפר למשך 15 שניות כדי לספק הגנה מוליכה. הפקדו מכסה פלטינה אורגומטלי בעובי 0.5 עד 1.0 מיקרומטר באמצעות מערכת הזרקת גז למשך כ-60 שניות.
מרח שכבת פלטינה מצופה ספטר סופית על פני הרשת בעוצמה של 30 מיליאמפר למשך 15 שניות. באמצעות תמונת קרן האלקטרונים של SEM, ניתן לנווט לאזור הנבחר ברשת הרקמה. כדי לכוון את הדגימה למילינג בצד הקדמי, כוון את השלב לסיבוב של כ-110 מעלות והטיה של 7 מעלות כדי להציג את פני הדגימה בזווית המתאימה לגישה לקרן היונים.
למילינג של תעלה, הגדר תעלה מלבנית סביב בלוק הרקמה המטרה באמצעות קרן יונים המופעלת ב-30 קילווולט. התחל לטחון במרחק מהבלוק באמצעות זרם גבוה יחסית של 15 ננואמפר כדי להשיג הסרה מהירה של חומר. כאשר קירות התעלה מתקרבים לבלוק עד כמה מיקרומטרים, הפחיתו את זרם קרן היונים ל-7 ננואמפר כדי להשיג שליטה מדויקת יותר במילינג.
השאירו צד אחד של הבלוק מחובר לחומר הגדול כדי ליצור לשונית אחסון זמנית. עבור בלוקי רקמה בעובי מוערך מעל 20 מיקרומטר, יש לבצע שלב חיתוך תת-קרקעי מהצד האחורי כדי להקל על ההרמה הסופית. סובב את הבמה וכיוון את ההטיה כדי להגיע לתחתית הבלוק.
לטחון את החיבור התחתון באמצעות קרן יונים ממוקדת ב-30 קילווולט וזרם של 3 ננואמפר. לטחן את תחתית בלוק המתכת כך שיתאים היטב לבלוק הדגימה. טחנו בדיוק את משטח המגע בין הדגימה לבלוק הזהב כדי להדק את המגע.
כדי לחבר את הדגימה למחט, ודא שגוש הזהב במגע ישיר עם הדגימה המטרה. באמצעות קרן יונים ממוקדת ב-30 קילווולט ו-0.5 ננואמפר, יש לבצע 8 עד 12 דפוסי חירום חתך רוחביים רציפים בממשק כדי לרתך את בלוק הזהב לדגימה. כדי להרים את בלוק הרקמה, חתך את הלשונית שנותרה שמחברת את הבלוק לדגימה הגדולה באמצעות קרן היונים הממוקדת.
תמרן בזהירות את מחט המיקרומניפולטור כדי להרים את בלוק הרקמה המבודד לחלוטין מהתעלה ומהרשת הסובבת. משוך את המחט והעביר את הבלוק לרשת המקלט. נווט את מחט המיקרומניפולטור לרשת מקלטים זהב עם 300 רשתות מקוררות מראש.
הורד את הבלוק על ריבוע רשת שנבחר. טחנו גבישי קרח קטנים מהרשת כדי לגרום לבלוק הרקמה והרשת להידבק חזק יותר. הורד את בלוק הרקמה כך שיגע רק ברשת.
טחנו פרוסה בעובי 3 עד 4 מיקרומטר מהבלוק אל סרט הרשת באמצעות קרן היונים. לאחר מכן, רתכו את הפרוסה בצורה בטוחה על ידי מילינג, תוך שימוש בדפוסי חתך ניקוי משני צידי הצומת, והחלו מחדש את הציפוי המוליך והמגן על פני הרשת כפי שהודגם קודם. לדילול למלה, לאחר הגדרת הטיית הבמה, הגדר את מיקום הלמלה הסופי באזור חלק של בלוק הרקמה.
לבצע מילינג שיטתי באמצעות זרמי קרן יונים ופיצויי הטיית יתר המפורטים בטבלה המוצגת. כאשר בטווח של 1 עד 2 מיקרומטר מהלמלה, ניתן לטחון תעלה להקלה על מתחים במרחק של כ-1.5 מיקרומטר כדי למנוע כיפוף או עיקול של הלמלה. לאחר הכנת הלמלה, יש לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני-קריו.
בלוקי רקמה שעובדו בהקפאה בלחץ גבוה בשיטת הוופל הציגו מראה אחיד ושקוף לאלקטרונים. טומוגרפיות משוחזרות פתרו מבנים מיטוכונדריאליים בסביבה התאית. קומפלקסים מקרומולקולריים, כמו ריבוזומים, נפתרו בבירור בציטופלזמה.
תכונות תאיות ציטוסקלטליות וקשורות לממברנה וקומפלקסים של נקבוביות גרעיניות נראו גם הן בטומוגרמות המשוחזרות. מבנים ותכונות סינפטיות, כולל מאגרי סידן ומבני מעטפת מיאלין, נראו בבירור בטומוגרפיות. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור את המבנה התא החיצוני הטבעי ישירות בתוך סביבות רקמה מורכבות.
האתגר הקריטי ביותר בפרוטוקול קריו-ET זה הוא השגת ויטריפיקציה אחידה וללא ארטיפקטים של דגימות רקמה עבה. בעקבות הליך זה, החוקרים יכולים לאתר אזורים בעלי עניין באמצעות מיקרוסקופיית אור ואלקטרונים מתואמת או טכניקות תיוג, ולאחר מכן לבצע ממוצע תת-טומוגרפי וניתוח מבנה לפתרון קומפלקסים מקרומולקולריים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
Overview
This article presents a comprehensive, standardized workflow for cryo-electron tomography (cryo-ET) of thick tissue samples, specifically demonstrated on mouse hippocampus. The protocol integrates rapid high-pressure freezing, precise cryo-focused ion beam (cryo-FIB) milling, and advanced imaging and data processing steps to enable high-resolution, in situ structural analysis of native cellular environments within complex tissues.
Key Study Components
Area of Science
- Structural biology
- Cryo-electron microscopy
- Tissue ultrastructure analysis
Background
- Cryo-ET allows 3D visualization of cellular ultrastructure in a near-native state.
- Application to thick tissues is limited by challenges in vitrification and lamella preparation.
- Existing protocols often lack reproducibility and throughput for complex tissue samples.
- Reliable workflows are needed for in situ analysis of macromolecular complexes within tissues.
Purpose of Study
- To establish a reproducible, end-to-end cryo-ET workflow for thick tissue samples.
- To optimize vitrification and lamella preparation for high-quality imaging.
- To enable high-throughput, artifact-free structural analysis of native tissue environments.
Methods Used
- Rapid dissection and high-pressure freezing (HPF) of tissue using a "waffle" assembly with copper foil.
- Transfer and mounting of tissue onto TEM grids, followed by vitrification within 90 seconds of dissection.
- Cryo-FIB milling for lift-out and thinning of tissue blocks to 120–200 nm lamellae, with over-tilt compensation and stress-relief trenching.
- Standardized conductive coating using sputter platinum and gas injection system (GIS) platinum cap.
- Automated, dose-symmetric tilt-series acquisition using PACEtomo scripts.
- Data processing with AreTomo 3 for motion correction, CTF estimation, alignment, and WBP reconstruction; optional IsoNet for missing-wedge correction.
- Subtomogram averaging and resolution assessment using RELION 4.0.
Main Results
- The workflow consistently produces well-vitrified, uniform lamellae (target thickness 150 ± 40 nm).
- High-throughput tilt-series collection is achieved (typically 5–8 minutes per tilt series).
- Reconstructed tomograms resolve key cellular structures, including mitochondria, ribosomes, cytoskeletal elements, nuclear pore complexes, synaptic features, calcium stores, and myelin sheaths.
- The protocol enables direct visualization and analysis of macromolecular complexes in situ within thick tissue samples.
Conclusions
- This standardized protocol overcomes major challenges in cryo-ET of thick tissues, particularly vitrification and lamella preparation.
- It provides a reproducible, high-throughput route for in situ structural biology studies in complex tissue environments.
- The workflow facilitates detailed analysis of native cellular architecture and macromolecular assemblies directly from tissue.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
High-resolution, in situ structural analysis of thick tissue samples is a critical bottleneck in early discovery and translational research. This standardized cryo-electron tomography (cryo-ET) workflow enables reproducible, artifact-minimized visualization of native cellular architecture directly from complex tissues, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The protocol's throughput and reliability position it as a foundational capability for enterprise-scale structural biology and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of macromolecular complexes within native tissue environments.
- Supports mechanistic de-risking by resolving cellular ultrastructure relevant to disease pathways.
- Facilitates functional target validation through high-fidelity visualization of subcellular features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by minimizing sample preparation artifacts.
Screening & Assay Development
- Prepares uniform, electron-transparent lamellae suitable for downstream high-throughput imaging workflows.
- Standardizes sample preparation to ensure reproducibility and quantitative comparability across experiments.
- Enables reliable assessment of compound effects on tissue ultrastructure in screening campaigns.
- Supports platform scalability and reuse for diverse tissue types with minimal adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural readouts with disease-relevant tissue models for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical validation in complex tissues.
- Reduces risk of late-stage biological failure by enabling early detection of ultrastructural phenotypes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on direct visualization of target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling robust, high-throughput structural analysis of thick tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct visualization of native macromolecular assemblies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative lamellae preparation for reliable downstream imaging and analysis.
- Analytics: Provides high-resolution tomograms and subtomogram averages for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease-relevant model validation using in situ tissue architecture.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized protocol adaptable across tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable sample preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM, cryo-FIB milling, and high-pressure freezing instrumentation.
- Demands access to advanced analytical infrastructure for automated tilt-series acquisition and data processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, vitrification, and lamella preparation protocols.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of dissection and freezing parameters.
- Uniform vitrification and artifact minimization are critical for reproducible, high-quality outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
High-Pressure Freezing of Thick Tissue for Cryo-Electron Tomography
1:44
Preparation of Receiver and Tissue Grids for Cryo-FIB Lift-Out
4:08
Tissue Block Isolation and Lift-Out
6:56
Block Attachment to the Receiver Grid
7:49
Lamella Thinning
8:36
Results
9:23
Conclusion
