ריצוף והרכבה של פלסמידים לקריאה ארוכה באמצעות זרימות עבודה מבוססות ריצוף ננופורי
July 7th, 2026
המחקר הנוכחי מתאר תהליך ריצוף ננו-נקבוביות של פלסמידים כאשר רצף הכרומוזומים כבר ידוע או אינו מעניין. שלב העשרת DNA בפלסמיד מבטיח עומק אופטימלי של רצף הפלסמידים וממקסם את מספר הדגימות שניתן לרצף בכל תא זרימה.
אנו חוקרים את השכפול, התחזוקה וההפצה של אלמנטים של DNA מעגלי המתשכפלים בעצמם, המכונים פלסמידים, דבר הדורש את קביעת הרצפים שלהם. פרוטוקול זה מתייחס לבעיות כיסוי ודיוק הקשורות לרצף קריאה ארוכה על ידי העשרת DNA של הפלסמיד ואופטימיזציה של שיטות הרכבה. הפרוטוקול שלנו נועד לרצף פלסמידים במצבים בהם הרצף הכרומוזומלי ידוע או לא רלוונטי.
כדי להתחיל, פזרו את הדגימות על צלחות LB מלאות בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה כדי לבחור את סמן ההתנגדות של הפלסמיד המתאים. דגרו את הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, חדרו שלושה עד חמישה מיליליטר של מדיום LB המלא בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה עם מושבה מבודדת יחידה.
דגרו את התרבות עם ניעור ב-37 מעלות צלזיוס במשך כשמונה שעות או עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-1-2. לאחר מכן, חדרו 400 מיליליטר של מדיום LB המלא בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה עם 400 מיקרוליטר מהתרבות הראשונית ודגרו כמו שהוצג קודם לכן. לאחר מכן, העבירו את התרבות לבקבוקי צנטריפוגה המתאימים לנפח התרבות.
צנטריפוגו ב-4,200 G למשך 10 דקות והשרו מחדש את המשקע באמצעות נפחי הריאגנטים המומלצים על ידי היצרן. לאחר פירוק התאים והנטרול, צנטריפוגו את הליזאט ב-4,200 G למשך 30 דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש וצנטריפוגו שוב.
בצעו שיווי משקל, שטיפה ואלציה של DNA על פי הוראות היצרן. לאחר מכן, השרו את ה-DNA המונע ב-100 מיקרוליטר של מים נטולי נקלזים כדי למקסם את הריכוז להכנת ספריית ננופור. לאחר מכן, כדי לכמת את ה-DNA, הכינו את צינורות הבדיקה כמצוין בטבלה המוצגת.
לאחר כיול הפלורומטר, הכנסו את צינורות הדגימות לפלורומטר ורשמו את הקריאות על פי מדריך המכשיר. תכנתו את המחזור התרמי ל-30 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ואז ל-80 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. סובבו ותנו מעבר לרכיבי הערכה שהופשרו כמצוין בטבלה המוצגת.
דגרו את צינורות ה-PCR המוכנים לסימון באמצעות תוכנית המחזור התרמי. לאחר מכן, הניחו את הצינורות על קרח כדי להתקרר. ערבבו את הדגימות המסומנות בברקוד בצינור אפנדורף נקי בנפח 1.5 מיליליטר, וודאו שהנפח הכולל לא יעלה על 1,000 מיקרוליטר.
לאחר שהחרוזים ערבבו בערבול, הוסיפו נפח שווה של חרוזים לדגימות הברקוד המאוגדות. ערבבו על ידי נפנוף בצינור, ואז החזיקו במשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את החרוזים עם מיליליטר אחד של 80% אתנול תוך כדי החזקה על המגנט.
הסירו את האתנול וחזרו על הפעולה. הסירו את הצינור מהמגנט. השרו את החרוזים במאגר אלציה באמצעות נפח מתאים על פי מספר הברקודים בשימוש ודגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
כמתו את ריכוז ה-DNA באמצעות מיקרוליטר אחד מהדגימה שהושמטה על הפלורומטר כדי לאשר הכנת ספרייה מוצלחת. להצמדת המתאם, העבירו 11 מיקרוליטר מהספרייה הגנטית לצינור חדש וסימנו אותו. לאחר מכן, ערבבו את הרכיבים המוצגים בצינור טרי כדי לדלל את המתאם המהיר שהופשר.
לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של מתאם מהיר מדולל ל-11 מיקרוליטר מהספרייה הגנטית ונפנפו בצינור כדי לערבב את התוכן. הורדו את הצינור בקצרה כדי לוודא שהנפח המלא מתאסף בתחתית ודגרו את הצינור על השולחן למשך חמש דקות. הכינו את תערובת הפרימינג של תא הזרימה בצינור DNA טרי ותרבו באמצעות היפוך ופיפטה.
הרמו את מכסה המכשיר והכנסו את תא הזרימה לתוכו תוך הפעלת לחץ עדין כדי לוודא מיקום נכון. לאחר שבדקו בוירוס אוויר בתוך או בסמוך לפתח הפרימינג, שאבו בחזרה 20 עד 30 מיקרוליטר של נוזל כדי להסיר
Overview
This article presents a detailed workflow for nanopore sequencing aimed at maximizing plasmid DNA yield and sequencing accuracy. The protocol encompasses plasmid extraction, rapid barcoding, adapter ligation, sequencing, and sequence assembly, and is suitable for a wide range of plasmid sizes and levels of chromosomal contamination. The method is demonstrated using Escherichia coli as a model organism.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- Genomics
- Microbiology
Background
- Plasmid sequencing is essential for genetic studies, recombinant gene expression, and plasmid capture experiments.
- Traditional sequencing methods may be limited by chromosomal contamination and low plasmid yield.
- Nanopore sequencing offers long-read capabilities and real-time data acquisition.
- Efficient workflows are needed to optimize plasmid sequencing throughput and accuracy.
Purpose of Study
- To develop and describe a robust workflow for nanopore-based plasmid sequencing.
- To maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy.
- To enable efficient parallel sequencing of multiple samples.
Methods Used
- Plasmid DNA extraction from clinical E. coli strains.
- Library preparation using rapid barcoding and adapter ligation.
- Loading libraries onto a nanopore flow cell for sequencing.
- Base calling performed in real time or post-hoc.
- Sequence assembly using Autocycler.
- Comparison of assemblies to gel mobility and short-read polished assemblies.
Main Results
- Plasmid assemblies matched sizes inferred from gel mobility.
- In two-thirds of cases, assemblies matched or closely resembled short-read polished assemblies (within 0.05% pairwise identity).
- Protocol supports plasmids from 4 to 174 kb in size.
- Up to 72% chromosomal contamination tolerated without loss of accuracy.
- Parallel sequencing of up to 24 samples achieved with optimal coverage.
Conclusions
- The workflow enables accurate and efficient plasmid sequencing using nanopore technology.
- It is suitable for plasmid verification, improving WGS-derived plasmid sequences, and sequencing plasmids captured by conjugation.
- The protocol is robust to chromosomal contamination and applicable to a range of plasmid sizes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Long-read nanopore plasmid sequencing enables high-confidence verification and assembly of plasmid constructs, supporting critical quality control and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This workflow addresses the challenge of chromosomal contamination and variable plasmid yield, providing robust, scalable solutions for recombinant DNA and gene therapy vector development. Its parallelization and tolerance for mixed DNA inputs streamline early discovery and preclinical workflows, enhancing portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of engineered plasmids for functional studies and target validation.
- Reduces ambiguity in construct identity, supporting mechanistic de-risking in discovery biology.
- Facilitates rapid triage of candidate constructs for downstream screening or expression.
Screening & Assay Development
- Provides validated sequence data for assay-ready plasmids, ensuring reproducibility in screening campaigns.
- Supports parallel sequencing of up to 24 samples, increasing throughput for construct libraries.
- Delivers quantitative sequence accuracy, enabling reliable comparison across engineered variants.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from discovery to preclinical studies by confirming plasmid integrity in disease-relevant systems.
- Enables sequence verification for plasmids used in gene delivery or biomarker studies.
- Supports risk-adjusted advancement by minimizing sequence-related uncertainties in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based workflow integrates from early construct verification through screening and preclinical validation, supporting both hypothesis-driven and translational research pipelines.
- Discovery Biology: Confirms plasmid sequence fidelity, reducing risk of off-target effects in functional assays.
- Screening: Ensures assay-ready constructs are sequence-verified, supporting reproducible compound evaluation.
- Analytics: Provides high-accuracy, quantitative sequence data for cross-sample comparison and quality control.
- Translational Research: Aligns plasmid sequence verification with preclinical model requirements for gene expression studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, parallelizable sequencing capability adaptable across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in construct-driven studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes plasmid verification, tolerates high chromosomal contamination, and supports high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring construct integrity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plasmid extraction, library preparation, and nanopore sequencing workflows.
- Demands computational infrastructure scaled to real-time or post-hoc basecalling needs.
- Benefits from standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to a range of plasmid sizes and host backgrounds, including high chromosomal DNA content.
- Best suited for applications where chromosomal sequence is known or not required.
