Name: ריצוף והרכבה של פלסמידים לקריאה ארוכה באמצעות זרימות עבודה מבוססות ריצוף ננופורי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: למד ריצוף והרכבת פלסמידים לקריאות ארוכות באמצעות ננופור. הפרוטוקול מייעל תפוקת DNA ודיוק ריצוף ב-Escherichia coli, תוך סבילות לזיהום כרומוזומלי עד 72%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf DNA LoBind tube</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP022431081</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>1.5 mL tube racks</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-313630</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>FALCON</td><td>352096</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>15 mL tube racks</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8850</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>2.0 mL microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-138</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>250 mL sterile flasks</td><td>PYREX</td><td>5320</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>C-103-50</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R-PR-R</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R-P-R</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Centrifuge bottles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B1283-4EA</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Disposable Inoculating Loops: 1 &micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-595</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Electronic Digital Scale</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-2001</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-720</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Ethanol-resistant markers</td><td>Sharpie</td><td>37001; 37002; 37003</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Flow cell (R10.4.1)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell Wash Kit</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH004</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>X-GEN</td><td>44-100M</td><td>כל מותג כפפות נייטריל עובד</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>432128</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>MinION Sequencing Device</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MIN-101B</td><td></td></tr><tr><td>Native Barcoding Kit 96 V14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-NBD114.96</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra MIDI Plasmid DNA Extraction Kit</td><td>Takara</td><td>740410.5</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube racks</td><td>AXYGEN</td><td>R96PCRFSP</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>PCR tubes: (0.2 mL)</td><td>AXYGEN</td><td>PCR-02-C</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Program autocycler v0.5.2</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program bcftools v1.22</td><td>Wellcome Sanger Institute (HTSlib / Samtools team)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program bwa v0.7.19</td><td>Heng Li, originally at the Broad Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program canu v2.3</td><td>University of California, Davis & Pacific Biosciences collaborators</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program flye v2.9.6</td><td>University of California, San Diego (Pavel Pevzner lab)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program medaka v2.1.1</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program metamdbg v1.2</td><td>INRIA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program miniasm v0.3</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program minimap2 v2.28</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program minipolish v0.2.0</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program porechop v0.2.4</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program racon v1.5.0</td><td>Genome Institute of Singapore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program samtools v1.22.1</td><td>Wellcome Sanger Institute (HTSlib / Samtools project)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; 4 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; Assay Tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Barcoding Kit 24 and 96 V14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RBK114.96</td><td></td></tr><tr><td>Set of micropipettes that dispense between 1 &ndash; 10 &mu;L (P10), 2 &ndash; 20 &mu;L (P20), 20 &ndash; 200 &mu;L (P200) and 200 &ndash; 1000 &mu;L (P1000)</td><td>RAININ</td><td>17008648; 17008650; 17008652; 17008653</td><td>Micropipettes should be calibrated</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>335905P</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Sterilized tips for 10 &mu;L, 200 &mu;L and 1000 &mu;L</td><td>Eclipse</td><td>1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000 Touch</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221052</td><td>ניתן להחליף למותג אחר</td></tr></tbody></table>

ריצוף והרכבה של פלסמידים לקריאה ארוכה באמצעות זרימות עבודה מבוססות ריצוף ננופורי

Long-Read Plasmid Sequencing and Assembly Using Nanopore Sequencing-Based Workflows

The present study describes a workflow for nanopore sequencing designed to maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy. Researchers cover each step ...

long-read-plasmid-sequencing-assembly-using-nanopore-sequencing-based

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Nanopore טכנולוגיה עבור רצפי מולקולות יש אפליקציות רחב במדעי החיים, כולל זיהוי של פתוגנים, ניטור בטיחות מזון, אנליזה גנומית, ניטור סביבתי metagenomic אפיון בקטריאלי עמידות לאנטיביוטיקה. במאמר זה, הוכח נוהל metagenomic אדמה רצפי DNA לצורך זיהוי מינים בטכנולוגיה רצף nanopore.

Nanopore רצפי DNA לניתוח Metagenomic אדמה

רצפי זמן-קריאה מאוד להקל על ההרכבה של הגנום מורכבים ואפיון של וריאציה מבנית. אנו מתארים שיטה כדי ליצור רצפים ארוכים במיוחד על ידי רצף nanopore מבוססי פלטפורמות. הגישה מאמצת הוצאה DNA ממוטבת ואחריו ההכנות ספריית ששונה כדי להפיק מאות קריאות kilobase עם כיסוי מתון של תאים אנושיים.

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

רצף Nanopore הוא טכנולוגיה חדשנית המאפשרת רצפי בעלות חסכונית במיקומים מרוחקים והגדרות משאב-עני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור רצף של mRNAs מתוך דם שלם התואם לתנאים כאלה.

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

בעבר שאנו אימות פרוטוקול עבור amplicon מבוסס הגנום השלם וירוס אוסוטו (אוסווי) רצף על פלטפורמת רצף nanopore. כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות בפירוט רב יותר ולקבוע את קצב השגיאה של תא הזרימה nanopore R10.

אימות הגנום השלם רצף Nanopore, באמצעות וירוס אוסוטו כדוגמה

פרוטוקול זה מפרט גישה מקיפה עבור כתות, רצף, ואת הרכב הגנום ההיברידי דה נובו של חיידקי השתן. הוא מספק הליך לשחזור ליצירת רצפי גנום מעגליים שלמים שימושיים בחקר יסודות גנטיים כרומוזומליים ואקסטרכרומוזומליים התורמים לקולוניזציה של שתן, פתוגנזה והפצת התנגדות מיקרוביאלית.

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה מהירה וחסכונית לאפיון גנומים של נגיף הכלבת (RABV) באמצעות טכנולוגיית ננו-נקבוביות. זרימת העבודה נועדה לתמוך במעקב מבוסס גנומיקה ברמה המקומית, לספק מידע על שושלות RABV מסתובבות ומיקומם בתוך פילוגניות אזוריות כדי להנחות אמצעים להדברת כלבת.

ריצוף גנום שלם לאפיון מהיר של נגיף הכלבת בטכנולוגיית ננופור

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מתרביות תאים ex vivo או in vitro לעיבוד מקדים של נתוני תמלול לסינון תרופות מבוסס תמלול חסכוני.

בדיקת תרופות מבוססת תמלול חסכונית

הרכבה in vivo היא שיטת שיבוט בלתי תלויה בקשירה המסתמכת על אנזימי תיקון DNA פנימיים בחיידקים כדי להרכיב שברי DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית. פרוטוקול זה הוא גם חסכוני בזמן וגם בעלות יתר, מכיוון שנדרשים מעט ריאגנטים, ויעילות השיבוט יכולה להגיע עד 99%.

שימוש במכלול In Vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה

פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לריצוף עמוק ממוקד של 18 אזורים עמידים לתרופות ב-Mycobacterium tuberculosis באמצעות פלטפורמת ריצוף לקריאה ארוכה, ואחריה ניתוח עם צינור ביואינפורמטיקה ספציפי לשחפת המיועד לנתונים לקריאה ארוכה.

ריצוף Amplicon באמצעות טכנולוגיות ריצוף לקריאה ארוכה

רצף תא בודד הוא כלי פופולרי ונגיש יותר ויותר לטיפול שינויים הגנומי ברזולוציה גבוהה. אנו מספקים פרוטוקול המשתמש רצף תא בודד לזהות שינויי מספר עותק תאים בודדים.

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

למד ריצוף והרכבת פלסמידים לקריאות ארוכות באמצעות ננופור. הפרוטוקול מייעל תפוקת DNA ודיוק ריצוף ב-Escherichia coli, תוך סבילות לזיהום כרומוזומלי עד 72%.

ריצוף והרכבה של פלסמידים לקריאה ארוכה באמצעות זרימות עבודה מבוססות ריצוף ננופורי

גלה סרטונים נוספים