ריצוף והרכבה של פלסמידים לקריאה ארוכה באמצעות זרימות עבודה מבוססות ריצוף ננופורי

אנו חוקרים את השכפול, התחזוקה וההפצה של יסודות DNA מעגליים המשתכפלים את עצמם, הידועים כפלסמידים, המחייבים את קביעת הרצפים שלהם. פרוטוקול זה מטפל בבעיות כיסוי ודיוק הקשורות לריצוף קריאה ארוכה על ידי העשרת DNA של הפלסמיד ואופטימיזציה של שיטות ההרכבה. הפרוטוקול שלנו נועד לרצף פלסמידים במצבים שבהם רצף הכרומוזומים ידוע או אינו רלוונטי.

כדי להתחיל, יש לפזר את הדגימות על פלטות מקדח LB עם האנטיביוטיקה המתאימה לבחירת סמן העמידות הרלוונטי שמופיע בפלסמיד. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, יש לחסן שלושה עד חמישה מיליליטר של מדיום LB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה עם מושבה מבודדת אחת.

דגרו את התרבית בניעור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-8 שעות או עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר תגיע לאחד עד שתיים. לאחר מכן, החסן 400 מיליליטר של LB Medium בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה עם 400 מיקרוליטר של תרבית ההתחלה ודגר כפי שהודגם קודם. לאחר מכן העבר את התרבית לבקבוקי צנטריפוגה המתאימים לנפח התרבית.

צנטריפוגה ב-4,200 גרם למשך 10 דקות והחזיר את הכדור לתלות באמצעות נפחי התגובה שהומלצו על ידי היצרן. לאחר ניתוק תאים ונטרול, בצנטריפוגה את הליזאט בטמפרטורה של 4,200 גרם למשך 30 דקות. העבר את הסופרנטנט לצינור חדש וצנטריפוגה אותו שוב.

בצע שיווי משקל, שטיפה והסרת DNA לפי הוראות היצרן. לאחר מכן תלה מחדש את ה-DNA המוצמד ב-100 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז כדי למקסם את הריכוז להכנת ספריית הננו-נקבוביות. לאחר מכן, כדי לכמת את ה-DNA, יש להכין את צינורות הבדיקה לפי הטבלה המוצגת.

לאחר כיול הפלואורומטר, הכנס את צינורות הדגימה לפלואורומטר ורשום את הקריאות בהתאם למדריך המכשירים. תכנן את המחזור התרמי ל-30 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ואחר כך 80 מעלות צלזיוס לשתי דקות. סובבו וערבבו את רכיבי הערכה המופשרים לפי הטבלה המוצגת.

דגרו את צינורות ה-PCR המוכנים לברקוד באמצעות תוכנית המחזור התרמי. ואז מניחים את הצינורות על קרח כדי להתקרר. אסוף את הדגימות המקודדות בצינור אפנדורף נקי בנפח 1.5 מיליליטר, כדי להבטיח שהנפח הכולל לא יעלה על 1,000 מיקרוליטר.

לאחר שהחרוזים עוברים מערבולות, הוסיפו נפח שווה של חרוזים לדגימות הברקודיות המאוגדות. ערבב על ידי לחיצה על הצינור, ואחר כך דגירה של 10 דקות. אחר כך שטוף את החרוזים עם מיליליטר אחד של 80% אתנול כשאתה על המגנט.

הסר את האתנול וחזור על הפעולה פעם אחת. הסר את הצינור מהמגנט. החזירו את החרוזים לבופר שחרור בנפח המתאים בהתאם למספר הברקודים בשימוש ודוגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

כמת את ריכוז ה-DNA באמצעות מיקרוליטר אחד של הדגימה שנמנעה על הפלואורומטר כדי לאשר הכנה מוצלחת של הספרייה. לקשירת מתאם, העבר 11 מיקרוליטרים מספריית ה-DNA לצינור חדש וסימן אותו. לאחר מכן מערבבים את הרכיבים המוצגים בצינור חדש כדי לדלל את המתאם המהיר המופשל.

לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של מתאם מהיר מדולל לספריית ה-DNA של 11 מיקרוליטר והפכו את הצינור לערבוב את התכולה. סובבו את הצינור לזמן קצר כדי לוודא שהנפח המלא מצטבר בתחתית ודגרו את הצינור על הספסל במשך חמש דקות. הכינו את תערובת הפריימינג של תאי הזרימה בצינור DNA טרי וערבבו על ידי היפוך ופיפטינג.

הרם את מכסה המכשיר והכנס לתוכו את תא הזרימה תוך הפעלת לחץ עדין כדי להבטיח מיקום נכון. לאחר בדיקת בועות אוויר בתוך או ליד פתח הפריימרינג, משך 20 עד 30 מיקרוליטר נוזל כדי להסיר בועות. לאחר מכן שלפו 800 מיקרוליטר תערובת פריימר ושפכו אותה לפתח הפריימר תוך הימנעות מבועות אוויר ותנו למכשיר לעמוד חמש דקות.

ערבבו את ספריית ה-DNA עם נפח חרוזי הספרייה המתאים בצינור חדש כפי שמוצג כאן. טעין 200 מיקרוליטר תערובת פריימינג לפורט של תאי הזרימה. כוון את כיסוי הפורט הדגימה כדי לחשוף את היציאה.

לשחרר 75 מיקרוליטר של ספריית ה-DNA עם חרוזים לפורט הדגימה טיפה אחת בכל פעם, לאפשר לכל טיפה לספוג לפני הוספת הבאה. לאחר מכן הניחו מחדש את כיסוי פורט הדגימה וסגרו את פתח הפריימינג. לאחר סגירת מכסה המכשיר, התחל בתהליך הריצוף.

קבע את מגבלת זמן הריצה לפי מספר הפלסמידים המולטיפלקסים, עם ברירת מחדל של 48 שעות ומקסימום של 72 שעות. בחר במצב קריאה בסיסי מדויק במיוחד ובאפשרות ערכת הברקוד המהירה. לאחר מכן בחר את נתוני FAST5 או POD5 הגולמיים והתחל לקרוא לבסיס.

כדי ליצור קובץ FASTQ מסונן להרכבה במורד הזרם, יש לקצר קריאות ארוכות באמצעות Filtlong כדי להסיר כ-5-10% מהקריאות באיכות הנמוכה ביותר תוך שמירה על כ-90% מהתפוקה הכוללת. סאב-דגימה נקראת באמצעות Autocycler לפי ההגדרות המומלצות. הרכיבו כל תת-קבוצה קריאה באמצעות Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler ועוד אסמבלי נבחרים.

תדמיין כל קובץ גרף אסמבלי באמצעות תחבושת. הערך את הקונטיגים למעגליות, עקביות בגודל בין המרכיבים וראיות למפרקים כימריים. הסר קונטיגים ליניאריים חסרי תמיכה בין מספר אסמבלים ושמר על קונטיגים מעגליים עם הערכות גודל עקביות.

הסירו קונטיגים קטנים לא נתמכים לפני יצירת קונצנזוס כאשר הפלסמידים הראשיים מעגליים. המשך ליצירת קונצנזוס לאחר אוצרות ידנית. יצר את רצף הקונצנזוס באמצעות Autocycler עם ההרכבות הנבחרות.

בצע את פקודות האוטוסייקלר שנותרו כדי לייצר את רצף הפלסמידים הסופי הקונצנזוס. ולבסוף, ללטש את ההרכבה הסופית באמצעות קריאות ארוכות ומצומצמות עם Medaka כדי לשפר את הדיוק הקונצנזוס. כל בדיקות הקונוגציה הפיקו טרנסקונוגנטים, שאישרו את נוכחות פלסמיד קונוגטיבי בתורמים.

גדלי רצפי הפלסמיד המורכבים היו תואמים להערכות המבוססות על ניידות אלקטרופורזה של ג'ל שדה פולס. ריצוף הננופורים יצר תפוקת קריאה ואיכות מספקת לכל הדגימות שנבדקו. שיעורי הזיהום הכרומוזומליים נעו בין 72.1% ל-28.0% עם ממוצע של 46.9% ניתוח אלקטרופורזה ג'ל שדה פולס של פלסמיד עיוות UPEC_271 חשף רצועה התואמת לפלסמיד של כ-145 זוגות קילובסיס.

ה-DNA מאחד הטרנסקונוגנטים הראה רצף זהה ל-145 קילובסיסים. ניתוח אלקטרופורזה של ג'ל שדה פולס של זן דם 100913 זיהה שני פלסמידים של זוגות של כ-70 ו-110 קילובסיס. ריצוף הננופורים אישר שתי הרכבות פלסמידים של 71,182 זוגות בסיסים ו-111,226 זוגות בסיסים.

השיקול החשוב ביותר הוא האם רצף הכרומוזומים מעניין אותו. אם כן, פרוטוקולי ריצוף גנום מלא סטנדרטיים טובים יותר. הכיסוי המורחב של הפרוטוקול שלנו פותח דלת לחקר ההטרופלזמיה, כלומר

שונות ברצף הפלסמידים בתוך אוכלוסייה נתונה.