לקטילציה ליזין ספציפית לאתר באמצעות התרחבות קוד גנטי ב-E. coli ובתאים יונקים

פיתחנו מערכת tRNA של שעון/RS כדי להתגבר על מגבלות חיקוי ואנזימים, מה שמאפשר שילוב מדויק של לקטילציה ליזין לחקר הביולוגיה שלו. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר מטבוליזם של גידול, תפקודי אנזימים ואתרי שעון. כדי להתחיל, לבצע קו-טרנספורמציה של 50 מיקרוליטר של תאי DH10B של Escherichia coli עם כ-100 ננוגרם מכל אחד מהפלסמידים הרצויים. דגרו את תערובת הטרנספורמציה על קרח במשך 25 דקות, ואז הפעילו אותה בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות.

תחזיר את הצינור לקרח לשלוש דקות. הוסיפו 350 מיקרוליטר של מדיום לוריה ברטני ונערו את הצינור בעוצמה ב-220 סיבובים לדקה למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כעת פיזרו את תרבית התאים המומרת על צלחת אגר Luria bertani בתוספת אמפיצילין וכלורמפניקול.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. לאחר מכן לבחור מושבה אחת מהצלחת כדי לחסן תרבית התחלה של ארבעה מיליליטר ולדגור אותה ללילה. למחרת, הרחיב את התרבית הלילית ל-400 מיליליטר של מדיום Luria bertani המכיל אמפיצילין וכלורמפניקול.

נער את התרבית בעוצמה במהירות של 220 סיבובים לדקה ו-37 מעלות צלזיוס עד שצפיפות האופטיקה ב-600 ננומטר מגיעה בין 0.6 ל-0.8. לאחר מכן השרה את התרבית עם 0.2% L-ערבינוז ולקטיל ליזין מילימולר אחד, ודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-220 סיבובים לדקה במשך 16 שעות. תאי זרעים נמצאים בלוח של 12 בארות בצפיפות של כפול 10 עד הספק של חמישה תאים בכל באר, תוך שימוש במיליליטר אחד של DMEM.

דגרו במשך 24 שעות עד שהתאחדות התאים מגיעה בין 70% ל-80% ואז המשיכו לטרנספקציה. להכנת תמיסת ה-DNA המדוללת, מוסיפים 0.75 מיקרוגרם של פלסמיד המכיל sfGFP reporter ו-pNeu-KlacRS ביחס אחד לאחד ל-38 מיקרוליטרים של DMEM ללא סרום עם סוכר גבוה. מפעיל פיפט עדין למעלה ולמטה או מערבולת קצרה כדי לערבב.

להכנת תגובת הטרנספקציה המדוללת, הוסף 2.25 מיקרוליטר של תגובת טרנספקציה ל-38 מיקרוליטר DMEM ללא סרום עם גלוקוז גבוה. טפחו בעדינות פיפט למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים כדי לערבב היטב. מיד הוסיפו את מגיב הטרנספקציה המדולל לתמיסת ה-DNA המדוללת בבת אחת.

כעת הפיפטה למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים כדי לערבב את התכולה ולדגור את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות כדי לאפשר ליצירת קומפלקסי הטרנספקציה וה-DNA. הוסיפו 50 מיקרוליטר של הטרנספקציה ו-DNA קומפלקס טיפות אל המדיום בכל באר וסובבו בעדינות את הפלטה כדי להומוגן את התערובת. שש שעות לאחר ההעברה, החלף את המדיום ב-DMEM טרי המכיל לקטיל ליזין מילימולר אחד ותרבית את התאים למשך 24 עד 48 שעות.

ב-Escherichia coli, hENO1-89Klac באורך מלא נוצר כאשר נוסף ללקטיל ליזין מילימולר אחד למדיום הגידול. בדיקת אימונובלוטינג אישרה את נוכחות hENO1-89Klac באורך מלא באמצעות נוגדנים אנטי-His ואנטי-L-לקטיל ליזין. זמן יינון אלקטרוספריי של ספקטרומטריית מסה בטיסה חשף שיא דומיננטי של 48,178 דלטון, תואם את המסה הצפויה של hENO1-89Klac ללא המתיונין המזיזם.

ספקטרומטריית מסה טנדם של העיכול הטריפטיך אישרה את השילוב הספציפי לאתר של Klac בשארית 89 באמצעות נוכחות מיפוי מלא של סדרת יוני B&Y לפפטיד המותאם. בתאי HEK293T יונקים, מיקרוסקופ פלואורסצנציה הראה ביטוי חזק של sfGFP בכל התאים כאשר Klac הוספה במשך 24 שעות ו-48 שעות, בעוד שלא נצפה פלואורסצנציה ללא תוספת Klac. ציטומטריית זרימה גילתה שכ-31% מהתאים הביעו sfGFP לאחר 24 שעות, ועלייה לכ-37% לאחר 48 שעות של תוספת Klac.

פרוטוקול זה מאפשר חקירת השפעות לקטילציה ליזין ספציפיות לאתר על תפקוד החלבון ומקל על מדידת תוצאות ביולוגיות ותפקודיות מתקבלות. לאחר תהליך זה, החוקרים יכולים לבצע מחקרים מכניים, לבצע בדיקות סקר בקצב גבוה, וליצור קווי תאים יציבים לניתוח פונקציונלי מורחב. המחקרים העתידיים שלנו שואפים לשפר את היעילות, לאפשר אינטגרציה יציבה ולפתח ביוסינתזה של שעון.