מודל עכברוש בצינור הלימפה הצווארי להערכת הובלה לימפה מהראש ומהמוח

הפרויקט שלנו בוחן כיצד לימפה מוחית קשורה למחלות מערכת העצבים המרכזית, כגון אלצהיימר, שבץ ודלקת עצבית, על ידי זיהוי חומרים שמתנקזים מהמוח. השיטות הקיימות חסרו פרוטוקול וגישה אמינה לדגימה ומדידת זרימת לימפה שמקורם במערכת העצבים המרכזית, כפי שמאפשר פרוטוקול זה. כדי להתחיל, טעינו מראש כ-0.7 מיליליטר של תמיסת נוגד קרישה מדוללת לתוך מזרק אינסולין סטרילי בנפח מיליליטר אחד עם מחט 30 גייג' לציפוי פני השטח הפנימיים של קנולה הפוליאתילן.

אחסן את המזרק הטעון מראש בתנאים סטריליים עד לשימוש. להכנת קנולות יש להשתמש בצינורות בקוטר חיצוני של 0.5 מילימטר וקוטר פנימי של 0.3 מילימטר לשני החלקים הסופיים, ובצינורות בקוטר חיצוני של 0.6 מילימטר וקוטר פנימי של 0.5 מילימטר לחלק האמצעי. באמצעות מספריים, חתכו את קטעי הקנולה לאורך של שני סנטימטרים לחלק הפרוקסימלי שמחובר למחט המזרק, 40 סנטימטרים לחלק האמצעי, ושמונה סנטימטרים לחלק הדיסטלי המיועד לקנולציה.

הרכיבו את הקנולה בתצורה ראש לזנב. לאחר מכן חתכו ומשופעים את הקצה הדיסטלי של מכלול הקנולה בזווית של כ-45 מעלות כדי לאפשר הכנסה חלקה לתעלה הלימפה הצווארית. בדוק את הפטנטיות של כל קנולה על ידי חיבור המזרק הטעון מראש לקצה הפרוקסימלי של הקנולה המורכבת.

שחרר בעדינות כמות קטנה של תמיסה כדי לשטוף את הקנולה. ודא שהתמיסה יוצאת בצורה חלקה מהקצה המרוחק ללא סימני דליפה. הצב חולדה מורדמת על שכב על כרית ניתוח מחוממת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הטי את הראש והאריך את הצוואר באמצעות כרית תמיכה קטנה, במידת הצורך, כדי להגדיל את החשיפה של אזור צוואר הרחם. הרסן בעדינות את הגפיים הקדמיות באמצעות גומיות או סרטי ניתוח כדי למזער תנועה. שטוף את הפרווה מעל אזור צוואר הרחם עם מי מלח סטריליים רגילים כדי להקל על הגילוח.

לאחר מכן, גלח היטב את כל אזור הניתוח כדי להבטיח הסרה מלאה של הפרווה לפני החתך. סמן את אתר הניתוח על ידי ציור קו מקווק של 2.5 ס"מ לאישור אורך החתך הראשוני. הניחו את הקצה העליון של החתך כ-1 עד 1.5 סנטימטרים מתחת לשפה התחתונה.

לאחר אישור עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטה של האצבע, חתך בזהירות את השכבה השטחית של שרירי צוואר הרחם לאורך הקו המסומן. לאחר מכן מפרקים בעדינות את שכבות השרירים הנותרות, בעיקר את הפאשיה הצווארית השטחית, כדי לחשוף את העורק הצווארי. למשוך את שריר הסטרנומסטואיד והבלוטה התת-לסתית, ולהטות אותם הרחק משדה הניתוח כדי להקל על זיהוי צינור הלימפה הצווארי.

השתמשו במרחיב רקמות כדי לשמור על חלון הניתוח. באמצעות מטוש כותנה, החזק זמנית את רקמת השריר בזמן איתור בלוטת הלימפה וצינור הלימפה הנלווה. אתר את צינור הלימפה הצווארי האטום וחסר הצבע המקביל לעורק התרדמת.

באמצעות מלקחיים קהים, עברו בעדינות דרך רקמות החיבור המופרדות ושמרו על המלקחיים במקומם. בודדו בקפידה את צינור הלימפה הצווארי מרקמות החיבור והשומן הסובבות באמצעות דיסקציה קהה. לאחר מכן יצרו חתך קטן בחצי העליון של כלי הדם החשוף.

ניתן ליצור דקירה משני קטנה בעור במרחק של כ-1.5 סנטימטרים מחלון הניתוח כדי לשמש נקודת קיבוע נוספת לקנולה. הכניס את הקנולה דרך הפתח השני, אחז בקצה המרוחק עם מלקחיים, וודא שהפנים המשופעות מופנות כלפי מעלה. לאחר מכן, מכניסים בעדינות את הקצה המרוחק כ-2 מילימטרים לתוך תעלת הלימפה דרך החתך, ומכוונים אותו לכיוון הראש.

עקוב אחרי הקצה הפרוקסימלי של הקנולה במשך דקה עד שתיים. אשר קנולציה מוצלחת על ידי צפייה בזרימה איטית ויציבה של נוזל הלימפה. אבטח את הקנולה על ידי מריחת טיפה קטנה של דבק רקמת ציאנואקרילט עם פיפטה באתר החתך ובחור הקיבוע המשני.

יש לעקוב אחרי זרימת הלימפה במשך מספר דקות כדי לאשר יציאה יציבה. לאחר מכן הסר בזהירות את מרחיב הרקמה, וממקם מחדש את בלוטת הלסת התת-לסתית למקומה המקורי. חבר צינור מיקרוצנטריפוגה מסומן מראש עם מצופה נוגדי קרישה לקצה המרוחק של הקנולה.

לאחר מכן ממקמים מחדש את כל שכבות השרירים למיקומן המקורי, וסגרו את חתך העור עם תפרים ו/או דבק רקמה. איסוף לימפה ברציפות לצינורות מיקרוצנטריפוגות מצופים נוגדי קרישה, והחלף את הצינורות במרווחים קבועים מראש, בדרך כלל כל שעה. ודא שהעכברוש נשאר מורדם לאורך כל תקופת האיסוף.

אחסן את הדגימות שנאספו עם שקיות קרח בקופסת קירור. קצב זרימת הלימפה בשעה שנמדד במהלך תקופת איסוף של שש שעות בעכברים שהועברו בהצלחה נע בין 0.09 ל-0.13 מיליליטר לשעה. בעכברים בריאים, ההובלה המצטברת של אלבומין שניתן תוך-סטריאלית ומסומנת בטריטיום נותרה זניחה בשעתיים הראשונות ועלתה משמעותית לאחר מכן.

השוואה בין ריכוזי אלבומין מסומנים בטריטיום בין לימפה לפלזמה הראתה פרופילי ריכוז שונים לאורך זמן בעכברים בריאים. דלקת עצבית שנגרמה על ידי מתן בין-פריטונאלי של Escherichia coli lipopolysaccharide הייתה קשורה לירידה קלה בקצב זרימת הלימפה הכולל במשך שמונה שעות וירידה כמעט כפולה בשיעור המינון הכולל שהועבר ללימפה. יחס הריכוז בין לימפה לפלזמה לא הראה הבדל משמעותי בין חולדות בריאות לחולדות עם דלקת עצבית, מה שמעיד על פרופילי ניקוי לימפה צוואריים דומים.

פרוטוקול זה אפשר דגימה ביולוגית ישירה של לימפה שמקורם במוח, תוך גישור בין הדמיה חיצונית עקיפה או שיטה שרפית לבין זרימת יציאה מדידה ממערכת העצבים המרכזית. הפרוטוקול מאפשר חקר פינוי תרופות המנוהל מרכזית דרך מסלולי לימפה, ומאפשר מדידת נתיבי ניקוז וקצב ניקוז. מחקרים עתידיים יוכלו לבחון כיצד מצבי מחלת מערכת העצבים המרכזית מתריעים לפינוי לימפה ולהשתמש בידע זה לאופטימיזציה של תרופות לשיקום תפקוד הלימפה המוחי לטיפול.