מיפוי חיסון תינוקות עם קלט מינימלי: פרופילינג אינטגרטיבי חד-תאי ומולטיאומי
3 באפריל 2026
פרוטוקול זה מתאר איסוף ושימור דגימות דם ממטופלים יילודים וילדים, וכן יישום של scRNA-seq, פרוטאומיקס וציטומטריית זרימה ספקטרלית לאפיון אוכלוסיות תאי החיסון מהדגימות הללו.
המחקר שלנו מגדיר כיצד מערכת החיסון המוקדמת מסתגלת לאחר הלידה באמצעות פרופילינג מולטיאומי ארוך מממד גבוה מנפחי דם קטנים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם במחקרים יילודים וילדים לפרופיל חיסוני אורך מדגימות ביולוגיות מוגבלות בתחומים בריאותיים, זיהומי ודלקת. כדי להתחיל, יש להפשיר במהירות בקבוקון המכיל תאי דם אדומים של תינוקות שפורקו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
העבר את התאים המופשרים לצינור חרוטי בגודל 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מדיום RPMI חם ושלם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה את הצינור בעוצמה של 400 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, וזרקו את הסופרנטנט. תלה מחדש את כדור התא בשלושה מיליליטר של מדיום RPMI מלא וסופר את מספר התאים הכולל.
לדלל את הדגימה אם הריכוז גבוה מדי כדי לספור. לאחר ספירת התאים, חזור על שלב הצנטריפוגה והשבית מחדש את התאים בתווך RPMI מלא כדי להגיע לריכוז של מיליון תאים למיליליטר. העבר 100 מיקרוליטרים המכילים 0.1 מיליון תאים לכל באר של לוח V-תחתית בן 96 בארות.
צנטריפוגה את הצלחת ב-764 גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של חומר צבע חי מת, מדולל מ-1 עד 2,000 ב-PBS עם בלוק FC ובלוק מונוציטים מדולל מ-1 עד 100 לכל הדגימות למעט הבקר הלא מוכתם.
דגרו את הדגימות במשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי לשטוף את התאים, הוסף 100 מיקרוליטר של PBS. צנטריפוגה את הצלחת ב-764 גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשליכו בזהירות את הסופרנטנט.
הוסיפו 100 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים שטחיים, מדולל מאחד עד 200 במיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה, או בופר FACS, לכל הדגימות למעט הבדיקה הלא מוצבעת. דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטוף את התאים עם 100 מיקרוליטר של בופר FACS, צנטריפוגה וזרוק את הסופרנטנט.
תקבע את התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 4% פאראפורמלדהיד לכל דגימה. דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ואז שטפו את התאים שוב, והשאירו מחדש ב-200 מיקרוליטר של בופר FACS. הכינו חרוזי פיצוי של UltraComp כבקרות צבע יחיד.
צבע את חרוזי הבקרה בצבע יחיד באותו תהליך כמו הדגימות, כולל קיבוע אם הדגימות היו קבועות. כמו כן, יש להכין פלואורסצנציה ללא אחד או בקרה FMO באותו אופן. הרץ את הדגימות, בקרות בצבע יחיד, בקרות ללא צבע ובקרות פלואורסצנטיות מינוס אחד על ציטומטר זרימה קונבנציונלי או ספקטרלי.
פתח את FlowJo ובחר את הדגימה המעניינת לניתוח. הגדר שערים באמצעות איזוטיפ ובקרות FMO מתאימות. לויקוציטים בשער באמצעות FSC לעומת SSC כדי להוציא פסולת, ובוחרים תאים לפי גודל וגרנולריות.
החריגו דאבלטים באמצעות FSCA לעומת FSCH. שער תאים חיים באמצעות צבע חיוני כדי להוציא תאים מתים. מתאים בודדים חיים, התחלק ללימפוציטים שליליים CD33 ותאי מיאלואידים חיוביים ל-CD-33.
בתוך תאים חיוביים ל-CD33, יש לזהות מונוציטים חיוביים ל-CD14. לאחר מכן, בתוך תאים חיוביים ל-CD33, יש לזהות תאי דנדריטיים חיוביים ל-CD14 וחיוביים ל-CD11C. כעת, בקרב לימפוציטים שליליים ל-CD33, תאי T חיוביים ל-CD3 ותאי הרג טבעיים חיוביים ל-CD3 וחיוביים ל-CD56.
בתוך תאי T חיוביים ל-CD3, יש לזהות תת-קבוצות חיוביות ל-CD8 ול-CD4 ולזהות תאי B שליליים ל-CD3, שלילי ל-CD56, ותאי B חיוביים ל-CD19. כדי להתחיל, הפשיר בקבוקון אחד של תאי דם אדומים ששומרו בקירור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. העבר את המתלה לצינור חרוטי בקוטר 15 מילליטר המכיל 10 מיליליטר מדיום T ובצנטריפוגה ב-430 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
זרוק את הסופרנטנט. לאחר השעיית כדור התא עם מיליליטר אחד של PBS, הוסף תשעה מיליליטרים נוספים של PBS לדגימה. צנטריפוגה את הצינור ב-430 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנאנט.
ספרו את התאים והערכו את הקיימות באמצעות הדרה של טרייפן בלו. אם היעילות היא פחות מ-70%, יש להשתמש בערכת הסרת תאים מתים כפי שקרה לך. ראשית, הכינו בופר קושר פעמיים על ידי דילול תמיסת בופר קושרת 20x במים סטריליים עם זיקוק כפול.
תלה מחדש את כדור התא ב-100 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים להסרת תאים מתים לכל 10 לכוח של שבעה תאים בסך הכל. ערבבו היטב ודגרו 15 דקות בטמפרטורת החדר. הניחו את עמוד ההפרדה המגנטי במעמד המגנטי המתאים, יחד עם צינור איסוף.
לאחר מכן איזון את העמודה על ידי שטיפה עם 500 מיקרוליטר של בופר קישור חד-פעמי. העלה את נפח המתלים של התא ל-500 מיקרוליטר עם מאגר קישור פי 1. לאחר החלפת צינור האיסוף, יש להחיל את מתלה התא על העמוד ולאסוף את הזרימה בצינור המיקרוצנטריפוגה החדש בנפח 1.7 מיליליטר.
לאחר מכן, שטפו את העמודה פעמיים עם 500 מיקרוליטר של בופר קישור ואספו את הזרימה באותו צינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה את האלואט ב-300 גרם למשך 10 דקות והשליך את הסופרנטנט. ספרו את התאים והערכו שוב את הקיימות באמצעות הדרה של טרייפן בלו.
Aliquot 20,000 תאים ברי קיימא לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.7 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב-300 גרם למשך 10 דקות והסרת הסופרנטנט. החזירו את התאים עם 40 מיקרוליטר PBS המכילים 0.04% BSA.
לבסוף, מניחים את הצינור המכיל התאים על קרח ושלחו אותו מיד למתקן ליבת גנום ליצירת ספרייה וריצוף. אסוף את תוצאות הריצוף בפורמט של פלטי Cell Ranger. דגימות כתמי דם מיובשות מתינוקות פגים ומביקורת עובדו.
והביטוי המנורמל של 92 חלבונים הקשורים למערכת החיסון נמדד בכמות. הביטוי של גן הפעלה ללימפוציטים שלוש ומתאם ממברנה 1 המווסת סף איתות היו גבוהים משמעותית בדם ההיקפי של תינוקות פגים בגיל חודשיים בהשוואה לדם הטבורי המועד. אסטרטגיית שער מקיפה שימשה לזיהוי אוכלוסיות לויקוציטים מדגימות תאי דם לבנים שעברו תאי דם אדומים שנפצעו.
בתוך אוכלוסיית תאי T, הובחנו תת-קבוצות חיוביות ל-CD4 וחיוביות ל-CD8. לאחר הסינון, נלכדו מעל 120,000 תאים ופרופילו במאגר הנתונים של ריצוף חומצות ריבונוקלאיות חד-תאיות. ניתוח הפחתת ממדיות ואשכול זיהו 14 אשכולות תאים מובחנים.
אשכולות תאים הוסמכו על בסיס גנים שבוטאו באופן שונה וסמנים ידועים של תאים. 12 מתוך 14 האשכולות התאימו לקו תאי חיסון, כולל תאי T, תאי רוצח טבעיים, תאי B, תאי מיאלואידים ונויטרופילים. גרף עמודות מוערם הדגים את היחס היחסי של התאים לכל אשכול לאורך שבוע, חודש וחודשיים של גיל.
מחקר זה מאפשר מדידת חתימות חיסוניות תאיות, טרנסקריפטומיות, פרוטאומיות ותפקודיות לאורך הדרך מדגימות דם בנפח מוגבל. מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בשיטות אלו כדי להגדיר מסלולי חיסון בריאים ולחשוף תגובות חיסוניות לא מאוזנות בגיל המוקדם הקשורות למחלות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים מיוטבים לאפיון חיסוני רב-ממדי בילודים תוך שימוש בנפחי דם מינימליים. באמצעות שילוב של טכניקות מתקדמות כגון ציטומטריה של זרימה (flow cytometry), פרוטאומיקה וריצוף RNA של תא בודד (single-cell RNA sequencing), המחקר מאפשר ניתוח אורך של התפתחות המערכת החיסונית של היילוד, גם בתינוקות עם משקל לידה נמוך במיוחד או בתינוקות שנולדו לפני הזמן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- מחקר ניאונטלי ופדיאטרי
- ניתוח של תא בודד
רקע
- מערכת החיסון של היילוד מסתגלת במהירות לסביבה חדשה ועשירה בגירויים לאחר הלידה.
- החסינות בשלבי החיים המוקדמים מותאמת באופן ייחודי לצרכים התפתחותיים, ולא היא פשוט לא בשלה.
- חקר החסינות של היילוד מהווה אתגר בשל נפח הדם המוגבל הזמין למחקר.
- פרופיל חיסוני מקיף דורש שיטות הממקסמות את כמות הנתונים המופקים מדגימות קטנות.
מטרת המחקר
- פיתוח והדגמה של פרוטוקולים לפרופיל חיסוני רב-ממדי מדגימות דם זעירות של רכים.
- מתן אפשרות למחקרים אורך של התפתחות מערכת החיסון ברכים ובפגים.
- תיעוד של חתימות חיסוניות תאיות, טרנסקריפטומיות ופרוטאומיות לאורך זמן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפשרה ועיבוד של דגימות תאי דם אדומים מולייסים מילודים.
- ציטומטריית זרימה עם אסטרטגיות gating מפורטות לזיהוי אוכלוסיות של תאי חיסון (T cells, B cells, NK cells, תאים מיאלואידיים, תאי דנדריטים, מונוציטים, נויטרופילים).
- ניתוח פרוטאומי של דגימות טיפות דם יבשות לכימות של 92 חלבונים הקשורים למערכת החיסון.
- ריצוף RNA של תא בודד (Single-cell RNA sequencing) הכולל הסרה של תאים מתים, הכנת ספרייה וניתוח אשגור (clustering) של למעלה מ-120,000 תאים.
- דגימה אורךית בנקודות זמן מרובות (שבוע אחד, חודש אחד, חודשיים).
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקולים אפשרו ביצוע פרופיל חיסוני מנפחי דם קטנים מאוד, המתאימים לילודים ולפגים.
- ביטוי גבוה משמעותית של lymphocyte-activation gene three ושל signaling threshold-regulating transmembrane adapter 1 בפגים בני חודשיים בהשוואה לדם חבל טורי של תינוקות שנולדו במועד.
- זיהוי ואנוטציה של 14 מקבצי תאים נבדלים, כאשר 12 מהם תואמים לשושלות חיסוניות ידועות.
- ויזואליזציה של שינויים דינמיים בפרופורציות של תאי מערכת החיסון לאורך שלבי החיים המוקדמים.
מסקנות
- השיטות המתוארות מאפשרות פרופיל חיסוני מקיף ואורכי (longitudinal) מדגימות דם מוגבלות של ילודים.
- גישות אלו מקלות על חקר התפתחות חיסונית תקינה ועל זיהוי תגובות לא תקינות הקשורות למחלה.
- הפרוטוקולים ישימים באופן נרחב למחקר חיסוני של ילודים וילדים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרופיל אינטגרטיבי של תא בודד ומולטי-אומיקה מנפחי דם מינימליים של רכים מאפשר תובנה חסרת תקדים לגבי התפתחות מערכת החיסון בשלבי החיים המוקדמים, ובכך מתגבר על מגבלות דגימה קריטיות במחקר פדיאטרי. גישה זו תומכת במיפוי ברזולוציה גבוהה של מסלולי חיסון, ומספקת מידע לצורך תיקוף מטרות והפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים המוקדמים ביותר של החסינות האנושית. הפרוטוקולים מאפשרים ניטור חיסוני כמותי ואורכי, המשפיע ישירות על החלטות במסלול התרגומי של תוכניות טיפוליות פדיאטריות וניאונטליות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של אוכלוסיות תאי חיסון ומסלולים בילודים תוך שימוש במינימום של דגימות ביולוגיות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי לכידת חתימות טרנסקריפטומיות ופרוטאומיות לאורך נקודות זמן התפתחותיות.
- מספק הפחתת סיכונים מכניסטית לתוכניות של אימונולוגיה פדיאטרית על ידי חשיפת התאמות חיסוניות ייחודיות בשלבי חיים מוקדמים.
- מסייע לביטחון ניבוי בבחירת מטרות עבור אינדיקציות ניאונטליות ופדיאטריות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מבסס תהליכי עבודה (workflows) מתוקשפים וניתנים לשחזור לזיהוי וכימות של תאי מערכת החיסון מדגימות בנפח נמוך.
- מנרמל אסטרטגיות של gating ובקרות עבור ציטומטריה של זרימה, ובכך מבטיח את מהימנות הבדיקה ואת יכולת ההשוואה שלה.
- מאפשר סריקה רב-ממדית וניתנת להרחבה (scalable) של פנוטיפים חיסוניים ופרופילים של ביטוי חלבונים.
- מכין מערכות ביולוגיות חסונות להערכת תרכובות בשלבים הבאים ולגילוי סממנים ביולוגיים (biomarkers).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים את תוצרי הפרופיל החסוני למודלים פדיאטריים וניאונטליים הרלוונטיים למחלה.
- תומך בגילוי ותיקוף של סמנים ביולוגיים לאורכיים עבור הפרות תפקוד חיסוני בשלבי חיים מוקדמים.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לדגימה ולניתוח חוזרים.
- מפחית סיכונים בקידום תרגומי באמצעות מיפוי מסלולים חיסוניים תקינים ובלתי תקינים בתינוקות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת הפרופילינג האינטגרטיבית הזו מגשרת בין גילוי מוקדם, סריקה ומחקר תרגומי, על ידי מתן אפשרות לניתוח חיסוני מקיף מדגימות ניאונטליות מוגבלות.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים בהקשר של חסינות בשלבי חיים מוקדמים.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של תאי חיסון וחלבונים, המתאימות לתהליכי עבודה בעלת תפוקה גבוהה.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות רב-אומיות (multiomic) ופלט סטטיסטי להשוואה חסונה של מצבי התפתחות ומחלה.
- מחקר תרגומי: תומכת בהלימה של סממנים ביולוגיים ובקידום מותאם-סיכון בתוכניות פדיאטריות וניאונטליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה לאפיון חיסוני במגוון יוזמות מחקר פדיאטריות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים חיסוניים פדיאטריים.
- ערך תפעולי: מאפשר פרופיל חיסוני סטנדרטי, הניתן לשחזור ובקנה מידה רחב, מתוך כמות מינימלית של חומר מוכר.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go ויעילות הון על ידי אספקת נתונים עתירי תוכן מדגימות מוגבלות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסים טיפוליים פדיאטריים וניאונטליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בציטומטריית זרימה (flow cytometry), ריצוף RNA של תא בודד (single-cell RNA sequencing) וניתוח נתוני פרוטאומיקה.
- דורש גישה למיכשור מתקדם ותשתית ביו-אינפורמטיקה לצורך אינטגרציה מולטי-אומיקה.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדת בין צוותים בטיפול בדגימות, בבניית שערים (gating) ובאסטרטגיות בקרה.
- ניתן להתאמה למערכות מודלים פדיאטריות ונאונטליות שונות באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מוגבל בשל הצורך בריאגנטים ייעודיים ובתמיכה של מעבדות ליבה לריצוף ופרוטאומיקה.
