מודל פגיעות היפוקסיה-חמצון מחדש בקרדיואידים אנושיים שמרכיבים את עצמם

המחקר שלנו מתמקד במציאת דרכים חדשות לסייע ללב להתחדש לאחר פציעה. לשם כך, אנו מייצרים אורגנואידים קרדיאליים שמרכיבים את עצמם ומבצעים מחקרים של היפוקסיה-חמצון חוזר. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לחקר תגובת פציעות, התערבויות טיפוליות לקידום התחדשות, וניתן להשתמש בו למידול מחלות ספציפיות למטופל.

כדי להתחיל, שאיפת מדיום מפרט המזודרם הלבבי D1 והוסף מספיק תמיסת היפרדות תאית כדי לכסות לחלוטין את תאי המזודרם הלבביים הפלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים שנגרמו על ידי האדם. לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. באמצעות פיפטה, הוסף נפח שווה של מדיום מזודרם קרדיאלי D2 לכל באר והפיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים הדבוקים, והעבר את תליית התא לצינור קוני של 15 מיליליטר.

באמצעות צנטריפוגה, פלו את התאים ב-300 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. החזירו את הכדור למיליליטר אחד של מדיום D2 במפרט המזודרם הלבבי המכיל חמישה IWP-2 מיקרומולריים ו-50 מיקרוגרם לחומצה אסקורבית למיליליטר ב-RB מינוס. מערבבים 10 מיקרוליטר של טרייפן בלו עם 10 מיקרוליטר של תליית התא במיקרוצינור.

ספירת התאים בשיטת הספירה המועדפת, ואז מדללת את התאים לריכוז של 100,000 תאים למיליליטר במדיית המזודרם הלבבית D2 עם שני תיזוביבין מיקרומולריים. העבר את תליית התא למאגר תגובה בגודל מתאים. לאחר מכן, באמצעות פיפטה רב-ערוצית, משחררים 100 מיקרוליטר לכל באר של לוח 96 בארות עם חיבור נמוך במיוחד כדי להגיע לריכוז סופי של 10,000 תאים בכל באר.

סובבו את הצלחת ב-500G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לגרום להיווצרות אורגנואיד לב אנושי בתרבות תלוי. צפה ביצירת כדור תאים גדול ומוקף היטב בכל באר. אם הגלולה אינה מוגבלת, יש לחזור על הצנטריפוגה.

לאחר 24 שעות, יש להכין 10 מיליליטר של מדיום D3 המכיל חמישה מיקרומולריים של IWP-2 ו-50 מיקרוגרם למיליליטר חומצה אסקורבית ב-RB מינוס כל צלחת. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה D3 לכל באר מבלי להסיר מדיה קיימת. למחרת, הסר 100 מיקרוליטר של מדיום D3 מכל באר.

כדי למזער את סיכון השאיפה, הטה את הלוח לזווית של 45 מעלות והחזק פיפטה רב-ערוצית בזווית של 90 מעלות לדופן הצלחת. הנח את הפיפטה היטב על קיר הבאר ושאיב לאט. לאחר הסרת המדיה, החליפו אותה ב-100 מיקרוליטר של מדיום D4 המכיל חמישה מיקרומולרים IWP-2 ב-RB מינוי.

באמצעות פיפטה בנפח 1,000 מיקרוליטר עם קצה חתוך, העבר את האורגאנואידים הלביים של האדם לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.7 מיליליטר. אפשר לאורגנואידים לשקוע לתחתית הצינור ולהסיר בעדינות את עודפי המדיה. הוסיפו מי מלח עם בופר פוספט כדי לשטוף את האורגנואידים פעם אחת.

המתן כמה שניות עד שהם ישקעו, והסיר בעדינות את עודפי ה-PBS. לאחר מכן, הוסיפו 4% פאראפורמלדהיד כדי לקבע את האורגנואידים והניחו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר קיבוע. לאחר מכן העבר את מספר האורגנידים הקבועים הרצוי לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.7 מיליליטר.

הסר את תמיסת התקבע ושטוף את האורגנידים עם PBS המכיל 0.1% ב-Tween 20. הכינו את תמיסת הנוגדנים הראשונית על ידי דילול הנוגדן לריכוז הרצוי בתמיסת הצביעה. באמצעות פיפטה, הוסף 50 עד 100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדן הראשית לכל צינור מיקרוצנטריפוגה, כדי להבטיח שהאורגנידים מכוסים במלואם.

לאחר דגירה ושטיפות לאחר מכן, דגרו את הדגימה עם נוגדן משני המדולל בתמיסת צביעה למשך 24 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על פלטפורמת ניעור. לאחר הדגירה, יש לבצע שטיפות כפי שתואר קודם. לאחר מכן, באמצעות קצה פיפטה חתוך, העבר את האורגנואידים לזכוכית טעונה חיובית.

הסר בעדינות עודפי PBS עם טווין 20 והוסיף כמה טיפות של מדיה להרכבה כדי לכסות את האורגנואידים. הנח בזהירות כיסוי על האורגנואידים כדי לשטח אותם. לאחר מכן המשיכו לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

לאחר דגירה של האורגנואידים הקבועים למשך הלילה בסוכרוז של 30% בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, העבירו אותם לתבנית פלסטיק והוסיפו טיפה קטנה של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לתבנית, בדיוק מספיק כדי לכסות את האורגנואידים. באמצעות פינצטה עדינה או קצה פיפטה, מקם בעדינות את האורגנואידים בתרכובת כך שלא יהיו גושים ויהיו רחוקים מקצוות התבנית. מקמו את האורגנואידים קרוב ככל האפשר לתחתית התבנית כדי למקסם את המספר הקיים בחתך קריואקטיבי יחיד.

הניחו את התבנית במקרר קלקר המכיל שכבת קרח יבש כדי להקפיא את שכבת התרכובת האופטימלית בטמפרטורת החיתוך הראשונית. המתינו כמה דקות עד שהתרכובת תתקשה ואז העבירו את התבנית למשטח העבודה. הוסיפו תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית נוספת עד שהתבנית מתמלאת.

תן לשכבה הראשונה להימס לגמרי לפני שמחזירים את התבנית לקרח היבש להקפאה מלאה. לאחר ההקפאה, יש לאחסן את התבניות בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס או לעבור לחתך קריומטרי לקבלת שישה מקטעים של מיקרומטר. באמצעות פיפטה, העבר חמישה מיליליטר של מדיום היפוקסיה על כל לוח אורגנואידי לב אנושי עם 96 בארות לבקבוק תרבית תאים.

הניחו את הבקבוקון בתוך תא היפוקסיה ושטפו אותו בגז אנוקסי המורכב מ-5% פחמן דו-חמצני ו-95% חנקן למשך שלוש דקות. הניחו את התא באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות שעה לפני תחילת היפוקסיה. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הסר כ-150 מיקרוליטר מדיה מכל הבארות של לוח האורגנואיד האנושי.

לאחר מכן, באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר, הסר בזהירות את המדיה שנותרה מכל באר בודדת מבלי להפריע לאורגנואידים. הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום היפוקסיה לכל באר. הניחו את לוח האורגנואיד הקרדיו האנושי בתא ההיפוקסיה.

ותשטוף את התא בגז אנוקסי המורכב מ-5% פחמן דו-חמצני ו-95% חנקן למשך שלוש דקות. הניחו את תא ההיפוקסיה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש שעות. כדי להתחיל חמצון מחדש, הסר את האורגנידים הלבביים האנושיים מתא ההיפוקסיה.

באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסף 150 מיקרוליטר של RB+מדיה מחוממת מראש לכל באר. לבסוף, הנח את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואפשר לפחות שלוש שעות של חמצון מחדש לפני ביצוע בדיקות במורד הזרם. לאחר שש שעות של היפוקסיה ו-24 שעות של רפרפוזיה, פעילות הדהידרוגנאז של לקטט חוץ-תאית עלתה משמעותית באורגנידים לבביים אנושיים פגועים בהשוואה לביקורת שלא נפגעה.

האורגנואידים הקרדיאליים שטופלו בהיפוקסיה הציגו גרעיני קרדיומיוציטים חיוביים ל-TUNEL, ואחוז גרעיני הקרדיומיוציטים החיוביים ל-TUNEL היה גבוה משמעותית בקרב אורגנואידים פגועים בהשוואה לבקרות שלא נפגעו. נצפה עלייה תלויה בזמן ביצירת הצלקות עם הארכת משך ההיפוקסיה לפני החמצון מחדש. ב-24 שעות לאחר ההחזרה, 69% מהאורגנואידים הלבביים האנושיים שלא נפגעו פעמו, בעוד שאף אחד מהאורגנואידים הפצועים לא פעם.

אורגנואידים קרדיאליים אנושיים שלא נפגעו הראו חולפים סידן מסונכרנים בחמישה אזורים מעניינים, כאשר שיאים התרחשו במקביל ועם צורות גל דומות. אורגנואידים לבביים שנפגעו בבני אדם לא הראו התכווצויות מתואמות, אלא הפגינו חולפים סידן ספונטניים לא סדירים באזורים הרלוונטיים. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקות אוטם שריר הלב באורגנידים לבביים אנושיים שמקורם ב-iPSC.

האתגר הטכני הגדול ביותר בהבטחת פציעה שניתנת לשחזור הוא הסרה מוחלטת של המדיה הקיימת. המחקרים העתידיים שלנו שואפים לזהות גורמים שיכולים לקדם רגנרציה של רקמות במודלים של אורגנואידים לבביים אנושיים.