יצירת מודל עכבר להפעלת מערכת החיסון של האם בהריון מוקדם להערכת דלקת טרום-לידית על התפתחות נוירולוגית

המעבדה שלנו חוקרת כיצד דלקת טרום לידית משנה את הביולוגיה של מיקרוגליה, תאי החיסון במוח התורמים לתוצאות נוירו-התפתחותיות שליליות. מודלים קיימים של MI מתמקדים באמצע ההיריון. עם זאת, אנו מציגים פרוטוקול הריון מוקדם הכולל בנוסף מדדי בקרת איכות לשיפור ההישרדות והעקביות.

המודל יכול להיות מיושם על כל סוג פראי או מודל עכבר גנטי כדי לחקור את השפעת הדלקת הסביבתית על התפתחות המוח. כדי להתחיל, הציב שתי נקבות C57 BL6 בגילאי שמונה עד עשרה שבועות עם זכרים מגדלים C57 BL6 בשעות אחר הצהריים המאוחרות או בערב. למחרת בבוקר, בדקו את העכברים הנקבות לפלאגים וגינליים והמשיכו לבדוק פעם ביום עד לביצוע סתימה.

הפקקים זמניים ועלולים ליפול עד הצהריים, אם לא יבדקו אותם בבוקר. לאחר אישור שיש פקק נרתיקי, שקלו את הנקבה ורשמו את המשקל כדי לעקוב אחרי מצב ההריון על ידי מעקב אחר עלייה במשקל לאורך ההריון. הפרדו את הנקבות בכלובים בודדים ושמרו אותן בתנאי מגורים סטנדרטיים עם גישה עדינה למזון ולמים.

סמן נקבות סתומות כיום עוברי 0.5 ורשם את תאריך הפקק הנרתיק כדי להבטיח מעקב מדויק אחרי גיל ההריון. כדי לשחזר את המעגל הפוליאוריתי הליופילי לתמיסת מלאי בריכוז גבוה, יש להמיס אותו במי מלח סטריליים או מים סטריליים לפי הוראות היצרן. מערבולת, תמיסת המלאי בריכוז גבוה.

לאחר מכן, מדללים את התמיסה במי מלח להכנת ציר בריכוז נמוך. כדי למנוע מחזורי הפשרה חוזרים, יש לשלב כ-125 מיקרוליטר מהחומר הנמוך לצינורות בנפח 1.5 מיליליטר, ולאחסן את הצינורות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס או 80 מעלות צלזיוס. מיד לפני ההזרקה ביום העוברי 9.5.

מדלל את קת הפוליאוריתן בעל ריכוז נמוך עם מלח סטרילי כדי לקבל ריכוז עבודה. חממו את המלאי העובד בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להבטיח שמבנה החומצה הריבונוקלאית הדו-גדילית הוא מחדש. לאחר מכן מערבולת, או פיפטה, את התמיסה כדי להבטיח תערובת הומוגנית לפני ההזרקה.

כדי לאשר הריון, שקלו את הסכר בבוקר של יום העובר 9.5. חשב את נפח ההזרקה בפולי-IC להפעלת מערכת החיסון של האימה, או MIA, ואת נפח ההזרקה של 0.9% לסליין עבור הבקרה. משוך את הנפח המתאים של תמיסת העבודה הפולי-IC המוכנה או המלח למזרק סטרילי בקוטר 27 או קטן יותר.

כעת, הרסן את הסכר כראוי כדי למזער כאב ומצוקה. הזריק את חומצה פולי-IC או תמיסת מלח תוך-פריטונית ברבע התחתון השמאלי או הימני מעל גובה הירך או בקבוצת הפטמות השנייה. לאחר מכן השליכו את המזרקים במיכל BioSafety Sharps.

כמו כן, תקליטו את צד ההזרקה כדי לשמור על עקביות בכל הקבוצה. החזיר מיד את הסכר לכלוב הבית ועקוב אחר סימני מצוקה. לאחר מכן הוסיפו לכלוב הידרוג'ל לפחות 24 שעות לאחר ההזרקה כדי למנוע התייבשות הקשורה להתנהגות מחלה.

לאחר מכן, רשמו את נפח מינון הפולי-IC שהוזרק, תאריך ושעת ההזרקה, גיל ההריון ומספר האצווה של הפולי-IC. שלוש שעות לאחר ההזרקה, התבוננו בכל עכבר בנפרד במשך דקה אחת והערכו התנהגות כמו פעילות מופחתת, יציבה כפופה, עיוות פנים או צואה מימית באמצעות סולם תלת-נקודתי. סווגו עכברים שמפגינים אחת או יותר מההתנהגויות הללו כבעלי התנהגויות מחלה חריפה.

לאחר מכן, באמצעות שיטה זעיר-פולשנית כמו דימום זנב, אספו בזהירות דם אם מהאם שהוזרקה. אסוף כ-50 מיקרוליטר דם. לאחר אישור ההמוסטזיס, החזירו את הסכר לכלוב הבית.

אפשר לדם שנאסף להיקרש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורה של 2000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להפריד את הסרום מהקריש. לאחר צנטריפוגה נוספת של הדגימה, אספו בזהירות את שכבת הסרום העליונה השקופה מבלי להפריע לקריש.

אחסן את הסרום בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, עד שיהיה מוכן לניתוח ציטוקינים במורד הזרם. לאחר ההזרקה, שקלו את הסמים מדי יום במשך שלושה ימים כדי לעקוב אחרי התגובה לחומצה פוליפוליאקית IC. ביום הלידה הצפויה, יש לתעד תוצאות של המלטה כולל גודל הגור, יכולת השריות של הגור, או היעדר המלטה כדי להעיד על הריון לא מוצלח.

להסיר מיד גורים שנפטרו ולהיפטר מהם בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית. השתמשו בבדיקות ELISA או במולטיפלקס כדי לכמת ציטוקינים דלקתיים כמו IL-6 ו-TNF-alpha בסרום האם לאחר MIA או הזרקות בקרה בהתאם להוראות היצרן. לאחר כמות, השתמשו בתוצאות כדי לקבוע סף מייצג לתגובת ה-MIA.

לבסוף, לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות התוכנה שלנו להערכת הקשר בין רמות IL-6 בסרום האם לרמות אלפא של TNF. לאחר מתן ה-poly IC ביום העוברי 9.5, סכרי MIA הראו רמות IL-6 גבוהות משמעותית ביחס לסכרי בקרה. רמות האלפא של TNF הראו מתאם חיובי חזק לרמות IL-6 אצל אם.

בין היום העוברי 0.5 ליום 9.5, אמהלות שילדו בהצלחה גור עלו במשקל משמעותית יותר מאמחות שלא הצליחו להוליד גור. יום לאחר ההזרקה, סכרי MIA ירדו במשקל, בעוד שסכרי בקרה מטופלים במי מלח עלו במשקל. אך ביום העוברי ה-12, שתי הקבוצות הראו עלייה דומה במשקל.

המשקל לפני ההריון לא השפיע על יעילות השגר לא בבקרת טיפול במי מלח ולא ב-MIA. עם זאת, עכברי C57 BL6 שמקורו במעבדות ג'קסון היו בעלי המלטה מוצלחת יותר מעכברי C57 BL6 שמקורו בצ'ארלס ריבר במהלך הליך ה-MIA. לעומת זאת, מקור ה-IC הפוליאמוריאלי לא השפיע על יעילות החול.

יתרה מזאת, בעלי חיים שמקורו במעבדות ג'קסון הציגו תגובה דלקתית אימהית חזקה יותר כפי שנמדדה בסרום IL-6 בהשוואה לבעלי חיים שמקורו בצ'ארלס ריבר. לעומת זאת, התגובה הדלקתית האימהית הייתה זהה בין מקורות שונים של פולי-IC. הפרוטוקול מאפשר יצירת מודל MIA מוקדם וקורלציה בין חומרת הדלקת האימהית לתוצאות ניסוי של הצאצאים. חשוב לשמור על רשומות מפורטות, לעקוב אחרי מספר המרכיבים ולהעריך את תגובות הציטוקינים האימהיים בכל הסכרים כדי להבטיח תוצאות שחזוריות.