סינתזה, קיפוזציה של המוגלובין ו-PEGylation ביאורתוגונלית בננו-חלקיקי UiO-66 היררכיים נקבוביים ליישומי אספקת חמצן

מטרת מחקר זה היא להגדיר מסגרות יציבות של מתכת-אורגני, ננו-חלקיקים מבוססי MOF למעטפת המוגלובין ולהעברת חמצן. מורף נקבובי היררכי יכול להתגבר על מגבלת גודל הפוסט למעטפת המוגלובין, ואוכלוסיית פני השטח יכולה לשפר את יציבות החלקיקים בסביבות פיזיולוגיות. בתחילה, שקלו בדיוק 50 מיליגרם של ננו-חלקיקי אמין מסוג UIO 66, נקבובי היררכית מוכנה, לתוך בקבוק תחתית עגול בנפח 25 מיליליטר.

הוסף 10 מיליליטר של טטרהידהידרופורן לבקבוק. לאחר מכן מבצעים אולטרה-סוניקציה של התערובת במשך חמש דקות כדי לפזר את החלקיקים במלואם, וליצור תלייה אטומה אחידה. הנח את הבקבוק העגול באמבט מים קרים על ערבוב מגנטי מכוון ל-400 סל"ד.

באמצעות מזרק זכוכית הוסיפו 0.4 מיליליטר של טרט בוטיל ניטריט בטיפה במשך חמש דקות, תוך שמירה על טמפרטורה מתחת לחמש מעלות צלזיוס. הוסף מיד 0.35 מיליליטר של טרימתיל SL אזיד בדרופ באותם תנאים קרים. עלולה להופיע התפרצות קלה, המצביעה על התקדמות חנקן.

לאחר מכן עטוף את אמבט המים הקרח בנייר אלומיניום כדי להגן על התגובה מהאור. המשך לערבב את תערובת התגובה באמבט מים קרים למשך הלילה. למחרת, שטוף ומייבש את המוצר כפי שמוצג.

לאחר מכן השתמשו בספקטרוסקופיית FTIR כדי לאמת את הטרנספורמציה הכימית. העבר חמישה מיליגרם של ננו-חלקיקי UIO 66 אזיד היררכיים לצינור צנטריפוגה בנפח שני מיליליטר. הוסיפו 0.5 מיליליטר של בופר HEPES וסוניקט במשך שתיים עד חמש דקות.

הוסף 0.5 מיליליטר של בופר HEPES המכיל 20 מיליגרם למיליליטר המוגלובין, והפך בעדינות את הצינור מספר פעמים כדי לפזר את הננו-חלקיקים במלואם. עכשיו מניחים את הצינור על שייקר תרמו ודגרו בטמפרטורת החדר עם ניעור ב-1,000 סל"ד למשך שעתיים. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצינור בעוצמה של 13,500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, כדי לשחרר את ננו-חלקיקי ה-UIO 66 אזיד הטעונים בהמוגלובין ההיררכית.

לאחר מכן אספו בזהירות את הסופרנטנט לצורך כימות של המוגלובין הלא כלוא. שטוף את הכדור בעדינות שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מים אולטרה-טהורים על ידי פיפסת צינור למעלה ולמטה כדי להסיר המוגלובין שנספג ברפיון. לאחר מכן אספו בזהירות את הסופרנטנט של כל שטיפה לצורך כימות ההמוגלובין הכלוא.

החזירו את הכדור האחרון ל-0.5 מיליליטר מים אולטרה-טהורים ואחסנו במקרר לפני האפיון. השתמשו בבדיקת ההמוגלובין סולפט של נתרן דפנה כדי לקבוע את ההמוגלובין הכלוא בסופרנטנטים שנאספו. פיפט 10 מיקרוליטרים מכל סופרנטנט לתוך מיקרופלטה של 96 באר.

הוסיפו 100 מיקרוליטר של נתרן סולפט לורל ודגרו חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך. באמצעות ספקטרופוטומטר אולטרה-סגול נראה, יש למדוד את הספיגה ב-412 ננומטר. לאחר מכן, יש להכין דילול סדרתי של מלאי ההמוגלובין במאגר HEPES ליצירת עקומה סטנדרטית.

העבר את הדילול המוכן ללוח הבאר 96 המוכן כדי ליצור עקומה סטנדרטית להמרת קריאות הספיגה לריכוזי המוגלובין. העבר 10 מיליגרם מננו-חלקיקי אזיד עמוסים בהמוגלובין ההיררכית ונקבוביים בצורת UIO 66 לצינור צנטריפוגה בנפח שני מיליליטרים, המכיל 0.5 מיליליטר מים אולטרה-טהורים וסוניקט למשך שתי עד חמש דקות. הוסף 20 מיליגרם דיבנזוציקלואוקטן, שעבר שינוי עם פוליאתילן גליקול כדי להשיג יחס אקווימולר בין פוליאתילן גליקול לננו-חלקיקים.

סובב בעדינות את הצינור עד שהתערובת מתאחדת. הנח את הצינור על שייקר תרמו ודוגר בטמפרטורת החדר, עם ניעור ב-1,000 סל"ד למשך שעה. לאחר מכן העבירו את הצינור למקרר שמתחזק בארבע מעלות צלזיוס לתגובה לילה.

צנטריפוגה את הצינור בעוצמה של 12,000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לפלוט את חלקיקי הפוליאתילן גליקול שעברו שינוי ועם המוגלובין, נקבובי היררכית, ננו-חלקיקים במידה UIO 66. לאחר מכן השליכו את הסופרנאנט, המכיל פוליאתילן גליקול לא תגובתי. שטפו את הגלולה שלוש פעמים במים אולטרה-טהורים של שני מיליליטר על ידי פיפסת צינור למעלה ולמטה וצנטריפוגה באותם תנאים שהודגמו קודם.

החזירו את חלקיקי UIO 66 פוליאתילן גליקול טעונים בהמוגלובין מטוהרים ונקבוביים היררכית, בשני מיליליטרים של מים אולטרה-טהורים. אחסן את המתלה בארבע מעלות צלזיוס. הקולואיד המתקבל נראה הומוגני ומעט אופלסינטי, מה שמעיד על יציבות פיזור טובה.

לאחר מכן תאשר פגילציה מוצלחת באמצעות פיזור אור דינמי, או DLS. קבוצות אמינו שטחיות הוסבו בהצלחה לאזידים. דבר זה הודגם על ידי הופעת רצועת מתיחה אסימטרית אופיינית של אזיד באורך 2,122 סנטימטרים הפוכים בספקטרום FTIR של ננו-חלקיקי אזיד UIO 66 הנקבוביים היררכית.

רצועה זו לא הייתה קיימת בננו-חלקיקי אמין UIO 66 נקבוביים היררכית. קיפוץ ההמוגלובין סומן חזותית על ידי שינוי צבע ברור מצהוב לאדום. קליטת החנקן ירדה לאחר טעינת המוגלובין, מה שמעיד על תפוסה של מולקולות המוגלובין במזופורות.

פוטנציאל הזטה של ננו-חלקיקי אזיד הנקבוביים היררכית, UIO 66, ירד מ-42.9 מיליוולט ל-20.4 מיליוולט לאחר עטיפת ההמוגלובין. הצמדת פוליאתילן גליקול מוצלחת אושרה על ידי היעלמות רטט המתיחה של האזיד ב-2,122 סנטימטרים הפוכים, והופעת אותות קשורים לפוליאתילן גליקול בספקטרום ה-FTIR. ניתוח DLS הראה עלייה בקוטר ההידרודינמי מכ-114.9 לכ-140.8 ננומטר לאחר פגילציה, תוך שמירה על PDI נמוך.

חלקיק זה מאפשר סינתזה של ננו-חלקיקי מורף נקבוביים היררכית, עטיפת המוגלובין, פרוקולציה על פני השטח והערכת פונקציונליות שחרור החמצן. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבצע אפיון כימי פיזיקלי נוסף ומחקר פונקציונלי, כולל ניתוח שחרור חמצן במבחנה ותאימות ביולוגית של ננו-חלקיקים. מחקרים עתידיים יכולים להתמקד בשימור תפקוד ההמוגלובין מסיבות ארוכות יותר, כגון שילוב רכיבים למניעת התדרדרות משמעותית.