שימוש ב-NMR בתמיסה לאפיון קונדנסטים ביומולקולריים בתנאים דו-פאזיים
17 באפריל 2026
כאן אנו מציגים פרוטוקולים לשיטות NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) ו-CONdensate DEtectioN באמצעות העברת מגנטיזציה SEmi-מוצק (CONDENSE-MT) המאפשרים אפיון כמותי ללא תוויות של קונדנזטים ביומולקולריים בתנאים דו-פאזיים, החושפים חלוקה מולקולרית, דינמיקת חילופיים, הידרציה של קונדנסאט ומבנה טיפות ללא שקיעה או תיוג.
פיתחנו שיטות NMR לחקר עיבויים ביומולקולריים. אלה מפתח לארגון התאים, אך כל המידע שלהם משתמע בהפרעות רבות. באמצעות שיטותינו, אנו חוקרים את תכונות חומר העיבוי, מנתחים את מנגנון היווצרותם, ומנטרים שינויים ארוכי טווח כגון בשלת עיבוי או פרפור פתולוגי של ביומולקולות.
כדי להתחיל, יש להכין את הדגימה הדו-פאזית הסופית שמיוצבת על ידי הידרוג'ל אגרוז על ידי ערבוב מאגרי החלבון, מאגרי ה-RNA, או שניהם עם בופר האגרוז החם המתאים בצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. ריכוז החלבון הסופי, או ריכוז ה-RNA, הוא בדרך כלל בין 50 ל-500 מיקרומולר לזיהוי NMR. הכנס את הדגימה הביפאזית המוכנה לספקטרומטר, ואז נעול, שימ, התאם וכוון את ערוץ הפרוטונים כרגיל.
כיול אורך הפולס של 90 מעלות בערוץ הפרוטונים באמצעות הליך הכיול הכללי. לאחר מכן הקליטו ספקטרום חד-ממדי עם דיכוי מים ובדקו אם הספקטרום מכיל אותות ביומולקולריים חזקים. אם לא נצפה או שיש מעט מאוד אות, אין להמשיך עם REDIFINE, אלא להשתמש ב-CONDENSE-MT במקום.
הקלט ניסוי ספקטרוסקופיה לפי דיפוזיה כדי לסדר את עוצמת גרדיאנט הדיפוזיה מ-2 עד 95% ב-16 שלבים ליניאריים. כדי להמשיך לאסוף נתונים עבור כל סט REDIFINE, צור תשעה ניסויי PPP GPQ S19 שלבים חדשים על ידי העתקת הפרמטרים מהניסוי הראשוני שזה עתה רץ. בכל ניסוי עוקב, יש לשנות רק את עיכוב הדיפוזיה D20 בשלבים משתנים כך שיעבור על טווח של 100 עד 1000 מילישניות.
הרץ כל אחד מהניסויים האלה עם הפקודה המתאימה. השתמש ב-N האחרון כדי לשמור על רווח המקלט לאורך 10 הניסויים. הגדר Q Sign עם SSB2 כפונקציית החלון.
לאחר מכן חילצו את הפרוסה החמישית באמצעות הפקודה המתאימה. שלב את הספקטרום החד-ממדי ושמור את פרמטרי השלב למערך הנתונים הדו-ממדי. עבדו את מערך הנתונים הדו-ממדי עם XF2 ובצעו תיקון בסיס עם ABS2.
אחר כך, חלץ את 16 הפרוסות עם 2D מפוצל. חזור על ההליך הדומה בתשעת הניסויים הנותרים. בדוק לפחות את ארבע עד חמש הפרוסות הראשונות כדי לוודא ששלב נכון ותיקון קו בסיס.
אם צריך, תקן ידנית את הפאזינג והבסיס הבסיסי. לאחר מכן השתמשו בקוד MATLAB המתאים לניתוח. בקוד, לשנות את זמני הדיפוזיה, להגדיר את ערכי ה-PG לפי עוצמת גרדיאנט הגלאי ולהקצה ניסויים אחד עד עשר בהתבסס על סך כל הניסויים.
לאחר מכן מתאימים את הנתונים לפי מודל REDIFINE באמצעות קוד זה. הקלט את ספקטרום המים המדוכא ב-1D. אם נצפים מעט מאוד אותות, יש להמשיך בניסוי CONDENSE-MT.
קבעו את קצב המים R1 באמצעות התאוששות מהיפוך T1 עבור CONDENSE-MT כמותית. העתק את רצף הפולסים שסופקו ואת רשימת ה-VD לתיקיות המתאימות. לאחר כיול הפולס של 90 מעלות, הגדרתי את NS ל-2, DS ל-0, D1 ל-20 שניות, SW ל-10 חלקים למיליון.
TD2 ל-16K ו-TD1 עד 24. לניסוי CONDENSE-MT, העתק את סט הפרמטרים, הרצף ורשימת התדרים של ברוקר לתיקיות הספציפיות של ברוקר. לאחר מכן כוון את התדרים וההספק בהתאם לספקטרומטר.
כוון את P1 לאורך פולס מכויל של 90 מעלות ואת P4 למיקרושנייה אחת לפולס העירוי כדי למנוע דיכוי קרינה. כוון את NS ל-2, DS ל-16, D1 ל-4 שניות, SW2 ל-20 חלקים למיליון, TD2 ל-8k, ו-TD1 לאורך רשימת התדרים. הגדר SPNAM10 ל-Squa100,000, וקבע את P10 לחמש שניות.
מצא את ההספק SP10 שמניב קרינה של 100 הרץ. כוון את עוצמת ה-SP10 של פולס הקרינה בהתאם. הרץ את הניסוי הדו-ממדי המדומה עם הפקודה המתאימה והקים סדרה של ניסויים דו-ממדיים מדומים, בעוצמות הקרנה משתנות של SP10.
לאחר כוונון כל הפרמטרים, הריץ את הקוד כדי לקרוא את ספקטרום ה-NMR, שמשלב את אות המים ושמור אותו במשתנה חדש. בשחזור היפוך הקוד, התאימו את הנתיב לנתונים המתאימים ובדוקו את אזור אינטגרציית המים. לאחר מכן התאימו את מספר הניסוי המכיל את נתוני השחזור של ההיפוך.
הגדר את כל הפרמטרים הניסיוניים והזן את ערכי האגרוז הריקים שהתקבלו בעבר על ידי התאמת מערך הנתונים של האגרוז באופן דומה. הרץ את החלק הראשון של קוד ריק מרוכז כדי לקבל את ההתאמה להרפיה אורכית למים. לאחר מכן הרץ את קטע ההתאמה הריק של העיבוי כדי להתחיל את האיור החי שמראה את המזעור של פונקציית ההתאמה.
הרץ את החלק הבא של הקוד כדי לקבוע את אי-הוודאויות ולשרטט את הנתונים. התאמת REDIFINE קבעה את מקדמי הדיפוזיה בשלבים המדוללים והמעובים, אוכלוסיית החלבון בפאזה המעובה, גודל הטיפה הממוצע וחדירות הבין-פאזה של דגימת הדומיין ה-N-טרמינלי של FUS. אות ה-NMR של תחום ה-N-terminal של FUS נשאר ניתן לזיהוי בפאזה המעובה.
לא נצפה הבדל בפרופיל העברת המגנטיזציה בין הפניה של האגרוז לתחום הקצה ה-N של FUS בדגימה פאזית. עבור עיבוי RNA חוזר ב-CAG, לא נצפה אות NMR. בהתאם לכך, פרופיל העברת המגנטיזציה שונה משמעותית מההתייחסות לאגרוז.
ניסוי CONDENSE-MT סיפק אפיון דינמי של עיבוי RNA בהרחבה חוזרת. ניתוח CONDENSE-MT הניב את הקינטיקה של חילוף הפרוטונים בין הקונדנסט למים בתפזורה. ניתוח CONDENSE-MT הניב גם את זמן ההרפיה הרוחבי של ה-RNA בקונדנסט ואת קצב ההרפיה הרוחבי הנראה של מים בתפזורת.
בפרוטוקול זה, ניתן לאפיין את תכונת העיבוי במצב דו-פאזי ללא צורך בתג כימי. הטיפות מתקיימות לצד סביבה מדוללת, ומאפשרות חילוף בין שני הפאזות המדמה את הסביבה התאית. השיטות שלנו המתמקדות באפיון קונדנסט יכולות להיות משולבות בשיטות NMR קונבנציונליות לחקר אינטראקציות מבנים מולקולריות ודינמיקה בין שלבים.
במחקרים עתידיים, אנו שואפים לפתח מודלים מורכבים יותר של עיבוי, להתאים את המתודולוגיה למערכות מורכבות יותר, ולבסוף לחקור עיבוי ישירות בסביבתם התאית.
סקירה כללית
מעבשים ביו-מולקולריים הנוצרים באמצעות הפרדה פאזית נוזל-נוזל (LLPS) ממלאים תפקיד מכריע בארגון הסביבה התוך-תאית ובבקרת תהליכים ביוכימיים. אפיון ההרכב, הדינמיקה והארגון הפנימי של מעבשים אלו הוא מאתגר, במיוחד ללא סימון חיצוני. מאמר זה מציג שתי שיטות משלימות של ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) המאפשרות ניתוח מקיף וללא סימון של מעבשים ביו-מולקולריים במצבם הבי-פאזי הטבעי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביוכימיה
- ביולוגיה מבנית
- ביופיזיקה
רקע
- מעבסות ביו-מולקולריים נוצרים באמצעות הפרדה פאזית נוזלית-נוזלית (LLPS) והם חיוניים לארגון התאי.
- שיטות מסורתיות לחקר קונדנסטים דורשות לעיתים קרובות תגים או סמנים חיצוניים.
- ספקטרוסקופיית NMR מציעה גישה נטולת סמנים לבחינת תנועה מולקולרית והטרוגניות סביבתית.
- הבנת תכונותיהם של קונדנסטים (condensates) חשובה לצורך קישור מבנם לתפקוד ביולוגי ולמחלה.
מטרת המחקר
- פיתוח והדגמה של שיטות המבוססות על NMR לאפיון קונדנסטים ביו-מולקולריים ללא תגים חיצוניים.
- כימות של חלוקה מולקולרית, דינמיקת חליפה וארגון פנימי של קונדנסטים.
- מתן מבט כמותי רב-ממדי על מבנה ודינמיקה של קונדנסטים בתנאים קרובים למצב הטבעי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גישת NMR של חילוף-דיפוזיה: דיפוזיה מוגבלת של מינים בלתי נראים (REDIFINE).
- NMR של העברת מגנטיזציה בחומר חצי-מוצק המזוהה באמצעות מים: זיהוי קונדנסטים על ידי העברת מגנטיזציה בחומר חצי-מוצק (CONDENSE-MT).
- מדידה של ניגודיות דיפוזיה, חילוף כימי וניגודיות רלקסציה.
- ניתוח של קצבי חילוף מולקולרי, גודל טיפות, חדירות ממשק, דינמיקת הידרציה ותוכן מים קשורים.
תוצאות עיקריות
- REDIFINE מכמת את חלק המולקולות המופרדות בין פאזות מרוכזות ומדוללות.
- קביעת גודל טיפות וחדירות הממשק באמצעות מדידות דיפוזיה והחלפה.
- CONDENSE-MT מנטר קונדנסטים באמצעות פרוטונים של מים בנפח (bulk water), ובכך חושף את דינמיקת החלוקה וההידרטציה.
- שתי השיטות מספקות אפיון מקיף וללא סימון (label-free) של מבנה ודינמיקת הקונדנסטים.
מסקנות
- השילוב של REDIFINE ו-CONDENSE-MT מרחיב את ארגז הכלים של ה-NMR לחקר הפרדה פאזית ביו-מולקולרית.
- שיטות אלו מאפשרות ניתוח כמותי רב-ממדי של קונדנסאטים ללא צורך בתגי זיהוי או תגים פלואורסצנטיים.
- גישה זו מניחה יסודות לקישור בין התכונות הפיזיקו-כימיות של הקונדנסאטים לבין תפקודיהם הביולוגיים והשיבושים הפתולוגיים בוויסותם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אפיון של קונדנסטים ביו-מולקולריים באמצעות NMR ללא סימון (Label-free) נותן מענה לפער קריטי בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי מתן אפשרות לניתוח כמותי ורב-ממדי של אסambleיות המופרדות פאזה בתנאים קרובים למצב טבעי. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים, ובכך תומכת בקבלת החלטות מושכלת לגבי תיק הפיתוח בנקודות השבחה מרכזיות. שילוב שיטות NMR אלו בתהליכי העבודה של הגילוי מחזק את הקשר בין התכונות הפיזיקו-כימיות של הקונדנסטים לבין תפקידם הביולוגי או הפתולוגי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה ישירה של הרכב הקונדנסטט והחלפה מולקולרית ללא שימוש בתגיות חיצוניות.
- תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות החלוקה וקצבי ההחלפה בין הפאזות.
- משפרת את הביטחון החזוי בבחירת המטרה על ידי חשיפת הדינמיקה והארגון של הקונדנסטט.
- מסייעת במיון תיקי פיתוח על ידי הבחנה בין מצבי קונדנסטט תפקודיים למצבים פתולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק תוצאות כמותיות מאומתות של מבנה התזקיק וההידרציה עבור בדיקות המשך.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי אספקת מדידות ניתנות לשחזור ללא סימון (label-free).
- מאפשר סריקה של מודולטורים המשפיעים על דינמיקת התזקיק או על התנהגות הפאזה.
- מקל על שימוש חוזר בפלטפורמה במערכות ביו-מולקולריות מגוונות המפגינות LLPS.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את התכונות הפיזיקו-כימיות של הקונדנסאט למנגנונים רלוונטיים למחלה כאשר הדבר נתמך על ידי פתולוגיה של LLPS.
- מאפשרת רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מעקב אחר מאפייני הקונדנסאט במודלים שונים.
- תומכת בקידום מותאם סיכונים על ידי אספקת ביומרקרים מכניסטיים וכמותיים של מצב הקונדנסאט.
- מספקת הפחתת סיכונים חזויה עבור מטרות המעורבות בהפרעות הקשורות להפרדה פאזית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטות NMR אלו ממוקמות בתוך רצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית דרך זיהוי מובילים (lead identification) ומחקר פרה-קליני, ובכך מאפשרות אפיון חסון של מנגנונים מונעי-קונדנסאט.
- ביולוגיה של הגילוי: מקלה על בדיקת השערות והבהרת מסלולים על ידי כימות חלוקה והחלפה מולקולרית.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות של דיפוזיה, החלפה והידרטציה להשוואת תנאים ולקבלת החלטות מושכלות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תכונות קונדנסאטים למנגנוני מחלה כאשר LLPS מעורב.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת NMR ניתנת לשימוש חוזר וללא סימון עבור מערכות קונדנסאטים מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והרחבה של ניתוח קונדנסאטים ללא סימון (label-free) בקרב צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות go/no-go טובה יותר ויעילות הונית על ידי הפחתת סיכונים במכניזמים ביולוגיים בשלב מוקדם.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מטרות רלוונטיות ל-LLPS.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ב-NMR של תמיסות ובביופיזיקה של הפרדת פאזות.
- דורש גישה למכשור NMR בשדה גבוה ולתשתיות אנליטיות.
- מפיק תועלת מסטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת דגימות וניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה למערכות קונדנסיות דינמיות וקשיחות כאחד, תוך שימוש בשיטות NMR משלימות.
- מוגבל לקונדנסיות הניתנות לגילוי באמצעות NMR או לניטור פרוטונים של מים כפי שמתואר.
