זיהוי מועמדים פוטנציאליים לאנטי-שחפת: מדריך שלב אחר שלב לסינתזה, קביעת MIC והערכת ציטוטוקסיות בתאי יונקים

מוקד המחקר שלנו הוא פיתוח ואימות של מועמדים חדשים לתרופות נגד שחפת שמטרתן לקדם אסטרטגיות טיפוליות. צינור הסקר הפנוטיפי המונע יכול לשמש בחיפוש אחר תרופות חדשות נגד זני מיקובקטריום טוברקולוזיס. כדי להתחיל, אספו את התגובות הנדרשות והמשיכו בהכנת תערובת התגובה באמצעות הפרופורציות המוצגות.

ערבבו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. השתמש במאייד סיבובי כדי להסיר את הממס. הוסיפו כ-20 מיליליטר של תמיסת נתרן ביקרבונט רוויה לשאריות.

סנן את המתלה באמצעות נייר סינון איכותי של תאית 11 מיקרומטר לאיסוף המוצקים השאריות. המיס את המוצקים השאריים ב-50 מיליליטר של כלורופורם. השתמש במשפך מפריד כדי לשטוף את תמיסת הכלורופורם עם 15 מיליליטר מים שלוש פעמים.

מסירים את שכבת המים בכל פעם. הוסיפו סולפט נתרן חסר מים לשלב האורגני כדי להסיר את שאריות המים ולייבש אותם. לאחר אידוי הממס, שטפו את המוצק הירוק המתקבל ארבע פעמים עם 10 מיליליטר הקסן חם בטמפרטורה של כ-50 מעלות צלזיוס.

למיליגרם אחד של תרכובת 6, מוסיפים מיליליטר אחד של תערובת של אצטוניטריל ומתנול להכנת תמיסה מלאי. דיללו את התמיסה המקורית ל-0.5 מיליגרם למיליליטר וסיננו אותה לפני הניתוח. טעין את הדגימה למערכת HPLC.

השתמש בתוכנת רכישת נתונים כרומטוגרפיה כדי לאסוף ולעבד את הנתונים. הגדר את שיטת הכרומטוגרפיה לשימוש בעמודת C18 בפאזה הפוכה בגודל 250 על 4.6 מילימטרים בגודל חלקיקים חמישה מיקרומטרים. קבע את קצב הזרימה ל-1.5 מיליליטר לדקה, וקבע זיהוי UV ל-254 ננומטר.

הגדר גרדיאנט כפי שמוצג עם שינויים מתוכנתים בהרכב פאזה ניידת. העבר כ-15 עד 20 מיליגרם של תרכובת 6 לצינור תהודה מגנטית גרעינית או NMR. המיס אותו בנפח מתאים של DMSOD6.

לאחר שפרמטרי הרכישה נקבעו כפי שמוצגים, רכוש את ספקטרום ה-NMR של הפרוטונים באמצעות רצף פולסים סטנדרטי. התאם את פרמטרי הרכישה. הפעל את ספקטרום פרוטון ופחמן 13 NMR ודווח על שינויים כימיים בחלקים למיליון.

הצג ועבד את נתוני ה-NMR באמצעות קובץ דעיכת האינדוקציה החופשי שהושג מהניסוי. לצורך טיהור מבוסס כרומטוגרפיה של תרכובת 6, יש למלא עמודה בג'ל סיליקה. טען את הקומפאונד 6 הגולמי על העמודה.

שחרר את התרכובת ואסף שברים. מעקב אחרי השברים באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה ומשלב את השברים המכילים את המוצר הטהור. הוסף 100 מיקרוליטר של מרק 7H9 בתוספת 10% אלבומין, דקסטרוז קטלז או ADC לעמודה 12 של הפלטה בת 96 הבארות.

לאחר מכן העבר 100 מיקרוליטר של מרק 7H9 המכיל 10% ADC ו-5% DMSO לעמודה 11. ואז ברצף מעמודה תשע לאחת. הוסף 200 מיקרוליטר של התמיסה המורכבת לעמודה 10, והקצה שורה אחת לכל תרכובת.

פיפט 100 מיקרוליטר של תמיסת התרכובת בריכוז הבדיקה כפול הגבוה ביותר לעמודה 12 של לוח 96 הבארות. העבר 100 מיקרוליטרים מעמודה 10 לעמודה תשע וערבב היטב על ידי פיפטציה כדי להתחיל דילול כפול של דגנים. המשך את הדילול הסדרתי ברצף עד עמודה אחת.

הוסיפו 100 מיקרוליטר של תסף חיידקי של Mycobacterium tuberculosis ברצף מעמודה 11 לעמודה אחת וכסה את הצלחת. אטום את הצלחת בפארפילם ודגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים. לאחר מכן, הוסף 60 מיקרוליטר של תמיסת רזאורין 0.01% לכל באר בצלחת וכסה אותה.

אטום את הפלטה בפארפילם ודוגר אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. ואז בדוק אם הצבע משתנה מכחול לורוד. הכינו תמיסה עובדת של 0.5 מיליגרם למיליליטר MTT ב-DMEM ללא סרום.

קבלו תאי Vero ו-HEPG2 שטופלו בתרכובת 6 למשך 48 שעות ובדקו אותם להערכת השפעות הטיפול. שואבים את המדיום מהלוחות והוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסת MTT לכל באר בתנאי תאורה סביבתית נמוכה. לאחר דגירה של שלוש שעות, הוסף 100 מיקרוליטר DMSO לכל באר כדי להמיס את גבישי הפורמזן בתנאי אור סביבה נמוכים.

הנח את הפלטה על רועיד מסלול במהירות 100 סל"ד למשך 15 דקות תוך שמירה על הגנה מפני אור. בדוק את בארות הבקרה כדי לוודא שהתמוססות גבישית מלאה. שים את הפלטה בקורא מיקרופלט.

הגדר את אורך הגל הייחוס בין 630 ל-690 ננומטר ובדוק את הספיגה ב-570 ננומטר. הכינו תמיסה אדומה ניטרלית של 40 מיקרוגרם למיליליטר ב-DMEM ללא סרום. לאחר מכן הכינו את תמיסת הדספורגיה האדומה הנייטרלית המכילה 1% חומצה אצטית קרחונית, 49% אתנול ו-50% מים אולטרה-טהורים בנפח.

לאחר הערכת השפעת תרכובת 6 על תאי Vero ו-HEPG2, הסר את המדיה והוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת העבודה האדומה הנייטרלית המסוננת לכל באר. דגרו את הצלחת במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני. לאחר הסרת התמיסה האדומה הנייטרלית שעובדת, שטוף כל באר פעם אחת עם 150 מיקרוליטר של PBS סטרילי.

הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסת הספיחה האדומה הנייטרלית לכל באר. הניחו את הפלטה על מנענע אורביטלי במהירות 150 סל"ד למשך 15 דקות כדי להוציא את הצבע. בדוק את בארות הבקרה כדי לאשר חילוץ צבע מלא.

קרא את הספיגה ב-540 ננומטר עם קורא מיקרופלט. כרומטוגרמת HPLC הראתה כי לתרכובת 6 זמן שמירה של 14.11 דקות וטוהר של 99%. ספקטרום ה-NMR של הפרוטונים הראה אותות אופייניים לחתיכת הפיפרידין בין 1.50 ל-3.13 חלקים למיליון. מתיל סינגלט ב-2.38 חלקים למיליון.

ואותות ארומטיים כולל דאבלטים ב-6.97 ו-7.17 חלקים למיליון, וכפולה ב-7.63 עד 7.75 חלקים למיליון. ספקטרום ה-NMR של פחמן 13 הראה אות פחמן מתיל של 23.81 חלקים למיליון, ואותות הקשורים לפיפרידין בין 24.85 ל-49.70 חלקים למיליון. פלטת ה-MTT הראתה גרדיאנט צבע ברור בין ריכוזי התרכובות, מה שמעיד כי ציטוטוקסיות הייתה הגבוהה ביותר בריכוזים גבוהים של תרכובות עם בארות שקופות והנמוכה ביותר בריכוזים נמוכים בבארות סגולות עמוקות.

לוח הספיגה האדום הנייטרלי הציג גרדיאנט צבע ברור על פני ריכוזי התרכובות, מה שמעיד כי ציטוטוקסיות הייתה הגבוהה ביותר בריכוזים גבוהים עם בארות שקופות והנמוכה ביותר בריכוזים נמוכים בבארות ורודות עמוקות. פרוטוקול זה מהווה צינור לפיתוח מועמדים לתרופות נגד שחפת בהתבסס על סקר פנוטיפי. חשוב לשקול ולהעריך את המסיסות הנמוכה של התרכובות המסונתזות בעת יישום הפרוטוקול.

מחקר זה יכול לשמש בסיס לזמינות ביולוגית עתידית, זיהום מקרופאגים ומחקרים ב-in vivo.