Name: תרגום mRNA ללא תאים במבחנה בליזטים של דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למד תרגום mRNA ללא תאים במבחנה בליזטים של דרוזופילה לחקר מנגנוני סינתזת חלבונים ובקרה תרגומית. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של תרגום בזחלי חרקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.</li>
	<li>Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.</li>
	<li>Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.</li>
	<li>Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5&#8242;-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.</li>
	<li>Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.</li>
	<li>Zapata JM, Mart&#237;nez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.</li>
	<li>Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.</li>
	<li>Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.</li>
	<li>Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.</li>
	<li>Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5&#8242; and 3&#8242; UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.</li>
	<li>Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.</li>
	<li>V&#225;zquez-Pianzola P, Hern&#225;ndez G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.</li>
	<li>Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.</li>
	<li>Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.</li>
	<li>Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.</li>
	<li>Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.</li>
	<li>Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.</li>
	<li>Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.</li>
	<li>Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.</li>
	<li>Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.</li>
	<li>Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.</li>
	<li>Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.</li>
	<li>Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.</li>
	<li>Kr&#252;ger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.</li>
	<li>Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.</li>
	<li>Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.</li>
	<li>Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.</li>
	<li>Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.</li>
	<li>Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user&#8217;s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.</li>
	<li>Hern&#225;ndez G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.</li>
	<li>Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td>רדיד אלומיניום ביתי סטנדרטי; כל מותג מסחרי מקביל מקובל.</td></tr><tr><td>תערובת חומצות אמינו</td><td>Promega</td><td>L4461</td><td>N/A</td></tr><tr><td>חומץ תפוחים</td><td>Heinz</td><td>N/A</td><td>חומץ תפוחים מסחרי (5% חומציות); כל מותג מקביל מקובל.</td></tr><tr><td>מיץ תפוחים או ענבים</td><td>Jumex</td><td>N/A</td><td>מיץ ענבים מסחרי; או כל מותג מסחרי מקביל.</td></tr><tr><td>אגר בקטריולוגי&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9002-18-0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>חומצה בורית (H3BO3)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>BioReagent, Molecular Biology grade, &ge;99.5%, אבקה; משמש להכנת חיץ TBE.</td></tr><tr><td>כובע: כובע נגד היפוך (ARCA): 3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)G מבנה כובע RNA</td><td>BioLabs</td><td>S1411S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>כובע: מבנה אנלוגי כובע RNA m7G(5')ppp(5')G</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>כובע: אנלוגי כובע לא פונקציונלי G(5&acute;)ppp(5&acute;)A</td><td>New England Biolabs</td><td>S1406</td><td>N/A</td></tr><tr><td>צנטריפוגה צינורית (15 מ"ל)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>תערובת מעכבי פרוטאז מלאה ללא EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>N/A</td></tr><tr><td>קריאטין פוספוקינאז משרירי ארנב</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>C-3755</td><td>N/A</td></tr><tr><td>חומצה קריאטית פוספורית, מלח דיסודיום</td><td>Merck</td><td>1120A47950</td><td>N/A</td></tr><tr><td>שמרים אפויים מיובשים</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>שמרים פעילים יבשים מסחריים; כל מותג מקביל מקובל.</td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>97%(NNR)</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>זן Drosophila melanogaster מסוג Oregon-R</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USA</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu/index.html ; זנים מוטציוניים של Drosophila melanogaster, כמו גם זני עיון מסוג בר של מיני דרוזופילה אחרים, כגון virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, וכו 'מסופקים גם על ידי מרכז המלאי הזה.</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמין טטרה-אצטית (EDTA)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>ACS reagent, 99.4-100.6%, אבקה; משמש להכנת חיץ TBE.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>SLBH4583V</td><td>99.5%(titration)</td></tr><tr><td>מימן חמצני (H2O2)</td><td>Equate</td><td>N/A</td><td>מסחרי (~2.5-3.5% פתרון מימן חמצני; כל מותג מקביל מקובל.</td></tr><tr><td>ערכת תמלול in vitro mMessage mMachine T7, T3, או SP6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1344 ו- AM1348</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KOAc, המכונה גם KCH3COO</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>כמה</td><td>N/A</td></tr><tr><td>נוזל Lb (lennox)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1kg&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת בדיקת לוספראז</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E1501</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ערכת תמלול in vitro MAXIscript T7, T3, או SP6</td><td>Invitrogen</td><td>AM1316 ו- AM1312</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mg(OAc)2, המכונה גם Mg(CH3COO)2</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>כמה</td><td>N/A</td></tr><tr><td>NaCl (נתרן כלוריד)</td><td>J.T Baker&nbsp;</td><td>B17W53</td><td>ACS Reagent</td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטידים</td><td>כל חברה</td><td>N/A</td><td>ספציפי לרצף.</td></tr><tr><td>מאגר פירוק pasive 5X</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>קצות צינורית</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td>קצות צהובים של 200 מיקרוליטר.</td></tr><tr><td>קצות צינורית</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td>קצות כחולים של מ"ל 1.</td></tr><tr><td>קצות צינורית&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td>קצות שקופים של 0.5-10 מיקרוליטר.</td></tr><tr><td>חומצה פרופיונית</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>79-09-04</td><td>דרגת ACS reagent, &ge;99.5%, נוזלי.</td></tr><tr><td>מכתש זכוכית 5 מ"ל PYREX&reg;</td><td>&nbsp; PYREX&reg;&nbsp;&nbsp;</td><td>7724-5</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ערכת QIAprep spin plasmid miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ערכת QIAquick למיצוי מגל</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N/A</td></tr><tr><td>תמצית רטיקוליטים מכבש ארנב (RRL)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>L4960</td><td>N/A</td></tr><tr><td>מערכת בדיקת רנילה לוספראז (RLuc)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2820</td><td>N/A</td></tr><tr><td>מעכב ריבונוקלאז RN

תרגום mrna ללא תאים במבחנה בליזטים של דרוזופילה

Cell-Free In Vitro mRNA Translation In Drosophila Lysates

תרגום mRNA ללא תאים במבחנה בליזטים של דרוזופילה

Cell-free mRNA in vitro translation has played a crucial role in the understanding of the protein synthesis process during gene expression across ...

המחקר שלנו עושה שימוש במערכת תרגום נטולת תאים של דרוזופילה כדי לבחון סינתזה של חלבונים וגילוי תרגומי בשלבים שונים של התפתחות חרקים. פרוטוקול זה משחזר במדויק אירועי תרגום in vivo הספציפיים להתפתחות חרקים, בניגוד לליזאטים ממטזואים רחוקים. כדי להתחיל, פתחו את תוכנת השכפול Benchling.בחר פלסמיד מתאים להחדרת המבנה המכיל אזור שאינו מקודד בקו 5', סיסטרון דוחף של לוקיפראז גחליליל, או Fluc, אזור שאינו מקודד בקו 3', וזנב פולי-אדנילאט או poly(A) במורד של פרומוטר T7. השתמש באתר הגבלה ייחודי של KPN1 הממוקם מיד במורד זנב ה-poly(A) כדי להפוך כל מבנה פלסמיד לליניארי לפני השעתוק. ודא כי הפיקים של המבנים שהתקבלו נקיים ומופרדים היטב על ידי ריצוף לפני השימוש בהם כתבניות לשעתוק in vitro.בצע הפרדה של ה-DNA הליניארי באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1% במתח של 100 וולט למשך שעה אחת. בצע הפקת ג'ל (Gel extraction) של ה-DNA הליניארי. העבר אותו למיקרו-טיובה והוסף תמיסת עיכול אגרוז או ADB לטיהור ה-DNA.דגרו את המבחנה ב-thermoshaker. לאחר מכן, העבירו את התוכן לעמודה ובצעו סנטריפוגה כדי להפיק את ה-DNA הלינארי. השתמשו בערכה לטרנסקריפציה in vitro כדי לבצע טרנסקריפציה ל-DNA הלינארי בהתאם להוראות היצרן.הפעילו את התרמוסייקלר ובחרו את התוכנית המתאימה. טפלו בכל תגובות השעתוק באמצעות DNase נטול RNase כדי להסיר את תבנית ה-

cell-free-in-vitro-mrna-translation-in-drosophila-lysates

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

אנו מתארים כאן את ההליכים למיצוי והטיהור של mRNA ומטבוליטים...

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית

בקרת סינתזת חלבונים מתרחשת בעיקר בשלב התחלת התרגום, ליקויים בו קשורים להפרעות מגוונות. כדי להבין טוב יותר את האטיולוגיה שלהם, תיארנו כאן פרוטוקול המשתמש בביציות Xenopus laevis המעריך את התרגום של תעתיק mos בנוכחות מוטציה של גורם התחלת התרגום eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד תרגום ספציפי לסוג התא של mRNA. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול TRAP הראשון המוקדש לבידוד mRNA באוכלוסיות תאים נדירות של עוברי דרוזופילה.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש באנזים Cas13D הממוקד ברנ"א (RfxCas13D) בזבובים.

פילוח RNA בכל מקום וריאקמה בדרוסופילים מלנוגאסטר באמצעות CRISPR/CasRx

מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

למד תרגום mRNA ללא תאים במבחנה בליזטים של דרוזופילה לחקר מנגנוני סינתזת חלבונים ובקרה תרגומית. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של תרגום בזחלי חרקים.

תרגום mRNA ללא תאים במבחנה בליזטים של דרוזופילה

גלה סרטונים נוספים