זיהוי היסטונים שעברו שינוי כסבסטרטים קשירים של בני משפחת הספינדלין האנושיים 4 (SPIN4) באמצעות מערכי פפטידים ומשיכת נוקלאוזום טבעית

SPIN4 הוא קורא היסטונים המווסת התפתחות עצמות. מוטציות SPIN4 גורמות לצמיחת יתר, אך תפקידה הפתוגני נותר לא ברור. פרוטוקול זה ניתן להתאמה ויישום לחקר סובסטרטים קושרים של חלבוני קישור היסטונים בכל החללים.

כדי להתחיל, יש להכין את הבופר החוסם על ידי שקילת חמישה גרם של אלבומין סרום בקר, או BSA, והמסה ל-100 מיליליטר של בופר אחסון חלבון BC-150. לאחר מכן, השתמשו בעט הידרופובי כדי לתאר את אזור התגובה על מערך הפפטידים לשימור התגובות. לאחר מכן מניחים ניירות סינון בצלחת פטרי בגודל 15 סנטימטר והרטיבם אותם במים.

מקם את המערכים על ניירות סינון רטובים והוסיף בזהירות 300 מיקרוליטר של בופר חסימה לכל אזור מערך. כסו ודגרו את צלחת הפטרי בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שלוש. הכינו מיקרומולר אחד של חלבון SPINDLIN-4 מתויג FLAG רקומביננטי, וחלבון FLAG SPIN4, ובקרת פפטיד 1X FLAG, כל אחד בבופר חסימה.

העבר את הריאגנטים וצלחת המערך לחדר קר כדי להפחית את הרקע ולשפר את יחס האות לרעש. הסר את מאגר החסימה העודף מהמערכים. הוסף את חלבון FLAG SPIN4, או בקרת פפטידים FLAG, לכל בלוק.

כסו את צלחת הפטרי לדגירה ללילה בחדר הקר. הוסיפו 50 מיליליטר של בופר שטיפה של מערך פפטידי לקופסת הכביסה. השליכו את תמיסת החלבון מהמערכים והעבירו אותם לבופר השטיפה כשהצד של התגובה כלפי מעלה.

שטוף את המערכים חמש פעמים. בצע את שתי השטיפות הראשונות למשך דקה אחת כל אחת, ואחריהן שלוש שטיפות נוספות של חמש דקות כל אחת. לאחר מכן שטוף עם בופר חוסם כדי להסיר שאריות אבקה.

החזר את המערכים לצלחת פטרי. הוסף 300 מיקרוליטר של נוגדן נגד FLAG לכל בלוק ודגר במשך שעה בטמפרטורת החדר. להשליך את תמיסת הנוגדנים, להעביר את המערכים לבופר השטיפה, ולחזור על השטיפות כפי שהודגם קודם.

הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית נגד עכברים IgG לעזים עם HRP ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. השליכו את תמיסת הנוגדן ושטפו את המערך חמש פעמים כפי שהודגם קודם. הניחו את המערכים בתוך מגן גיליונות שקוף והוסיפו מיליליטר אחד של מצע כימילומינסנציה משופרת, או ECL, כדי להבטיח כיסוי אחיד.

הסר בועות אוויר כלואות. ללכוד כימיולומינסנצנט בתמונות שדה בהיר באמצעות מצלם דיגיטלי. לאחר העלאת קובץ הנתונים הגולמי לתוכנת ניתוח מערך פפטידים של Histone Modified, בלשונית יישור הנקודות, ודאו שכל רשת ממוקדת בנקודת הפפטיד שלה.

בסטטיסטיקות נקודתיות, בדוק מתאם נקודתי כפול וודא שהשגיאה מתחת ל-5% השתמשו בלשונית הריאקטיביות כדי להעריך את הקישור בין שינויים שונים בהיסטונים. לאחר מכן השתמשו בלשונית הספציפיות כדי לקבוע את העדפת הקשר היחסית של פפטיד היעד בין שינויים שונים בהיסטונים. להכנת בופר חסימת חרוזים פי 2, הוסף גרם אחד של BSA לתוך 10 מיליליטר של בופר ליזיס BC-150 ומערבולת כדי להמיס.

העבר חרוזי FLAG SPIN4 מסוג פרא ו-FLAG SPIN4 D82H עם ריכוזים אקווימולריים לצינורות נפרדים בנפח 1.5 מיליליטר. לדגימה מסוג פראי, הוסף נפח שווה של חרוזי בקרה שליליים של 1X FLAG פפטיד 1X בגודל 100 מילימולר. כוון את כל הדגימות לנפחים אחידים באמצעות כמות מתאימה של בופר ליזיס BC-150.

הוסיפו נפח שווה של בופר חסימת חרוזים 2X לכל צינור כדי להגיע לנפח הסופי למיליליטר אחד. דגור במהלך הלילה על סיבוב צינורות שמוגדר בארבע מעלות צלזיוס ו-20 סל"ד. כדי להתחיל קישור נוקלאוזומים, יש להפשיר 1X מונונוקלאוזומים שהופקו מתאי HEK293FT על קרח.

לאופטימיזציה ראשונית, חשב יחס מולרי אחד לאחד של נוקלאוזום 1X לחלבון SPIN4. מערבבים 1X נוקלאוזום עם נפח שווה של 2X בופר חסימת חרוזים. לאחר מכן מערבבים את התערובת עם חרוזים חסומים מראש בצינור של 15 מיליליטר ודגרו במשך ארבע שעות על סיבוב צינורות בארבע מעלות צלזיוס ו-20 סל"ד לקומפלקס.

צנטריפוגה את התערובת ב-3000 גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנאנט, החזירו את החרוזים למיליליטר אחד של בופר ליזיס BC-150 והעבירו לצינורות של 1.5 מיליליטר. כדי לשטוף את החרוזים שלוש פעמים, יש להשתמש בצנטריפוגה ב-3000G למשך דקה.

לאחר השלכת הסופרנאנט, החזירו את הכדור למיליליטר אחד של בופר ליזיס BC-150. ערבב את הצינור מדי פעם לחלוקה אחידה של החרוזים בין שטיפות חוזרות. לאחר מכן מבצעים שתי שטיפות נוספות, כולל שלב דגירה של 10 דקות על רוטטור במהירות 20 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס בין שלב ההשעיה מחדש לצנטריפוגה.

לאחר השטיפה הסופית, תלו מחדש את החרוזים בתשעה כרכים של בופר ליזיס BC-150. מערבבים 160 מיקרוליטר של חרוזים מכל דגימה עם 40 מיקרוליטר של 5X Laemmli buffer. חממו ב-95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לצורך דה-דנאטורציה.

באופן אופציונלי, כדי לקבל תוצאות נקיות יותר עם רקע מצומצם, יש לבצע אשליית פפטיד FLAG של קומפלקס הנוקלאוזום החלבוני. צנטריפוגה ב-3000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מבצעים צביעת כסף ו-Western blotting כדי לאמת ולזהות את קישור ההיסטון SPIN4 המותאם.

SPIN4 נקשר באופן משמעותי להיסטון H3 ליזין 4, או H3K4, מונומתיל, דימתיל וטרימתיל פפטידים. לעומת זאת, מוטנט אובדן התפקוד ב-SPIN4 D82H הראה ירידה בקישור לכל המטרות, מה שמאשר שדומיין טיודור 1 חיוני לקשירת סובסטרט. הזיקה הקשירה של SPIN4 מושפעת לרעה משינויים פוסט-תרגומיים אחרים שמבקשים אישורים, כמו H3R2me2s ו-H3R2me2a.

תצפיות עקביות על מערך פפטידים, SPIN4 D82H הראה הפחתה כוללת בקישור נוקלאוזום ביחס ל-SPIN4 מסוג פראי. ניתוח ווסטרן בלוט שהשווה את דגימות המשיכה של SPIN4 ו-SPIN4 D82H הראה גם כי אין קישור כמותי של SPIN4 D82H לפפטידי מונומתיל, דימתיל או טרימתיל H3K4, מה שמאשר גישות כפולות אלו לזיהוי מהיר של סובסטרטים יחסיים של שינוי היסטון לאחר תרגום. אימות מהיר וממוקד של הסובסטרטים הקשורים של חלבוני קישור היסטונים.

התנאים הנדרשים לביטוי ולטיהור חלבוני הקשר ההיסטוני של כל מועמד עשויים להשתנות. ספקטרומטריית מסה של היסטון לאחר משיכת מונונוקלאוזום טבעית תספק את מלוא טווח ה-PTMs של היסטונים.