מודל עכברים מקיף להערכת מסלולי העברת כבד באמצעות דגימת לימפה וכלי דם בו-זמנית
15 במאי 2026
פרוטוקול ניסויי זה מתאר מודל עכברוש מחובר לצינור לימפה כבד, המאפשר הערכה ישירה וכמותית של ניקוז לימפה וכלי דם בכבד. המודל מאפשר דגימה סימולטנית של לימפה כבדית ודם מערכתית כדי לחקור העברת כבד, מטבוליזם ואיתות חיסוני, ותומך במחקרים של פרמקוקינטיקה של תרופות וביולוגיה ספציפית לכבד.
המעבדה שלנו חוקרת את תפקיד מערכת הלימפה במחלות דלקתיות וקרדיומטבוליות ומפתחת אסטרטגיות למתן תרופות לטיפול במחלות הלימפתיות. פרוטוקול זה מאפשר הערכה של תהליכים כבדיים, כולל מטבוליזם תרופות, זרימת חומרים מזינים, איתות חיסוני ותגובת כבד בתנאים מגוונים. כדי להתחיל, הניחו עכברוש זכר של ספרג-דולי מורדם במשקל של כ-250-300 גרם, שהועבר בהצלחה דרך עורק התרדמה ווריד הג'וגולרי, בשכיבה גבית תחת מיקרוסקופ כירורגי.
יש ליצור חתך אופקי בעור באורך 4-5 סנטימטרים מהקו האמצעי לצד ימין, כ-1.5-2 סנטימטרים מתחת לכלוב הצלעות. למשוך את העור ולבצע חתכים תואמים בשרירים האלכסוניים החיצוניים והפנימיים. צרוב או קשור כל כלי דם גדול שנפגשו במהלך ההליך.
השתמשו במקליות כותנה לחות במי מלח כדי להזיז את הכבד לכיוון הסרעפת, את הקיבה שמאלה, ואת המעי הדק לכיוון התחתון. השאירו את האיברים נסוגים עם גזה ספוגה במי מלח. זהה את צינור הלימפה הכבדי המקביל ומעט הזנבי לעורק הכבד, מדיאלי לכליה הימנית וסמוך לווריד הנבוב התחתון.
השתמש בצינור הלימפה המזנטרי הגדול והאטום או הלבן כסימן אנטומי לזיהוי צינור הלימפה הכבדי השקופ והצר הממוקם בזנב. השתמש במלקחיים ישרים של גראף כדי להסיר את רקמת החיבור שמעל צינור הלימפה והווריד הנוב. הכניסו את המלקחיים דרך שכבת השומן מתחת לכליה הימנית כדי ליצור מנהרה מתחת לווריד הנוב.
קדימו את המלקחיים עד שהקצוות יוצאים במקביל לצינור הלימפה הכבדי בצד הנגדי של הווריד הנבוב. השתמש במלקחיים כדי לאחוז בקצה החיצוני של הקנולה המוכנה מראש ולמשוך את הקנולה דרך המנהרה עד שהקצה שלה יוצא בצד הנגדי. השתמשו במלקחיים של Halsted Mosquito Hemostat כדי לכופף את קצה מחט 25 גייג' לכ-90 מעלות.
באמצעות המחט הכופפת, יש לנקב בזהירות את תעלת הלימפה הכבדית בצד ימין הקרוב ביותר למפעיל. בדוק את הקנולה המלאה מראש בתמיסת נוגדי קרישה והסירו בועות אוויר, אם יש. הכנס את הקצה המשופע כ-2 מילימטרים לתעלה.
אשר את זרימת הלימפה בקצה החיצוני של הקנולה בכ-100 מיקרוליטר לשעה. כוון או הכנס מחדש את הקנולה אם לא נצפית זרימה. סתום את הקנולה בקצה האיסוף, ואז מרח טיפה קטנה של דבק וטרינרי כדי לאבטח את אתר ההכנסה.
ברגע שהדבק יבש, ודאו את זרימת הלימפה דרך הצינור. לאחר מכן, הסירו את הגזה והחזירו את האיברים למקומם המקורי. הניחו את צינור האיסוף המכיל את תמיסת נוגד הקרישה מתחת ליציאת הקנולה וודאו שהלימפה זורמת לתוך הצינור.
לאחר מכן סגרי את דופן הבטן על ידי תפירת שכבות האלכסון הפנימי, האלכסוני החיצוני והעור ברצף. מיד לאחר הקנולציה הלימפה הכבדית, יש להתחיל בהידרציה מחדש על ידי הזרקת מי מלח סטריליים בקצב של 1.5-3.0 מיליליטר לשעה דרך קנולה וריד היוגולרי. מעקב אחרי נשימה ורפלקסים תוך שמירה על הרדמה באמצעות קונוס אף.
לאחר מינון טיפולי דרך קנולה הווריד היוגולרי, יש לאסוף את הלימפה הכבדית באופן רציף לצינורות המכילים תמיסת נוגדי קרישה. החלף את צינורות האיסוף כל שעה או לפי הצורך. איסוף דגימות דם מעורק התרדמה בנקודות זמן מוגדרות, תוך שמירה על נפח כולל מתחת ל-10% מנפח הדם המשוער במחזור לפני דגימה סופית.
פתח מחדש את חתך הבטן כדי לחשוף את חלל הבטן העליון תוך שמירה על הרדמה עמוקה ונשימה יציבה. השתמש בגזה רטובה במי מלח כדי למשוך בעדינות את הכבד לכיוון הסרעפת, הקיבה משמאל, והמעי הדק תחתון. זהה את עורק הכבד המקביל לצינור הלימפה הכבדי הסמוך לתעלת הלימפה המזנטרית.
השגת קנולה פוליוויניל בקוטר חיצוני של 0.61 מילימטרים וקוטר פנימי של 0.28 מילימטרים, ממולאת מראש בתמיסת נוגד קרישה והסרת בועות אוויר. באמצעות מלקחי קשתית מעוקלים, בודדו קטע קצר מהעורק הכבדי. שים תפר משי 4-0 מתחת לעורק.
הרם בעדינות את העורק ומניח תפר שני רחוק לראשון. לקשור את התפר הדיסטלי כדי לשלוט בזרימה החוזרת תוך השארת התפר הפרוקסימלי פתוח לסגירה מאוחרת יותר. באמצעות מספריים מיקרו דקים, יש לבצע חתך רוחבי קטן במרחק של כ-0.5 מילימטרים בדופן העורק בין התפרים.
השתמשו בקצה מלקחי דומון כדי להרים את פתח הכלי ולייצב את לומן הכלי להחדרת הקנולה. הכנס את הקצה המפותל של קנולה הפוליוויניל לתוך הפתח וקדם את הקנולה כ-2-3 מילימטרים. אבטח את הקנולה על ידי קשירת התפר הפרוקסימלי סביב הכלי והקנולה.
אשר את המיקום הנכון על ידי שאיפה עדינה של כמות קטנה של דם עורקי אדום בוהק. אסוף 0.5-1 מיליליטר דם לצינור מסומן מראש המכיל נוגד קרישה. התאוששות לימפה של טיפולים מקרומולקולריים הניתנים תוך ורידי בלימפה חזה, כבדית ומזנטרית מדגימה את תועלת המודל בהערכת הובלה לימפטית.
לימפה כבדית כוללת תכולת שומנים כוללת נמוכה משמעותית מלימפה חזה ומזנטרית, בעוד שריכוז החלבון שלה דומה לזה של מקורות לימפה אחרים. פרוטוקול זה מאפשר מדידות סימולטניות של לימפה ודם כבד כדי להעריך את ההעברה, המטבוליזם והניקוי של מולקולות, כולל תרופות, חומרים מזינים ואותות. קנולציה מדויקת של צינור הלימפה הכבדית היא מאתגרת טכנית ודורשת זיהוי אנטומי מדויק וטכניקת ניתוח.
מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בטכניקה זו למיפוי הובלה, ניקוי ומטבוליזם של הכבד, ולקדם את ההבנה של מחלות כבד וטיפולים ממוקדים.
סקירה כללית
הכבד מתפקד כמרכז מטבולי ואימונולוגי מרכזי, המעבד רכיבי תזונה, קסנוביוטיקה ומתווכי חיסון המגיעים דרך הווריד הפורטלי והעורקי הכבדי. חומרים חודרים להפטוציטים ולתאים כבדיים אחרים דרך נימי הסינוסואיד, כאשר תסנין הפלסמה מתנקז למרחב דיס (space of Disse) לצורך טרנספורמציה מטבולית, מעקב חיסוני או ניקוז לימפטי כלימפת כבד. מאמר זה מתאר מודל כירורגי בחולדות המאפשר דגימה סימולטנית של זרימת לימפת הכבד ושל דם סיסטמי באמצעות קנולציה של צינור הלימפה הכבדי, העורקי הגרוני והווריד הג'וגולרי. המודל תומך בדגימה רציפה של לימפת הכבד ודם עורקי, עם גישה לווריד הג'וגולרי לצורך הידרציה או איסוף דם ורידי, דבר המאפשר השוואה בין דם עורקי לוורידי. קצבי זרימה של לימפת הכבד, העומדים על כ-0.1 mL/h בחולדות תחת הרדמה, מאפשרים דגימה רציפה של לימפה למשך עד 8 שעות, בעוד שדם עורקי וורידי נדגמים בו-זמנית. דגימה סופית של העורקי הכבדי והווריד הפורטלי בסיום הפרוצדורה מאפשרת השוואה ישירה בין הזרימה הנכנסה לכבד, הזרימה היוצאת והניקוז הלימפטי. פלטפורמה רב-גונית זו מקלה על הערכה של תהליכים כבדיים כגון פרמקוקינטיקה של תרופות, שטף ומטבוליזם של רכיבי תזונה, ותגובות ספציפיות לכבד תחת תנאים פתופיזיולוגיים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- הפטולוגיה
- פיזיולוגיה
- פרמקוקינטיקה
רקע
- הכבד מקבל אספקת דם כפולה מווריד השער (דם מעייים עשיר בחומרי הזנה) ומהעורק הכבדי (דם סיסטמי מחומצן).
- נימי הסינוסואיד מאפשרים חילופים בין הדם לתאי הכבד (הפטוציטים), כאשר התסנין של הפלזמה חודר למרחב דיס (space of Disse).
- הלימפה הכבדית נושאת חומרים שעברו שינוי מטבולי וגורמים חיסוניים, המשקפים את תפקודי הכבד.
- דגימה סימולטנית של דם ולימפה מאפשרת ניתוח של ספיגה, מטבוליזם והפרשה בכבד.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל כירורגי בחולדות לדגימה רציפה וסימולטנית של לימפה כבדית, דם עורקי ודם ורידי.
- אפשור השוואה ישירה בין זרימה נכנסת לכבד (וריד השער, עורק הכבד), זרימה יוצאת (ורידי הכבד) וניקוז לימפטי.
- תמיכה בניתוח מקיף של הובלה כבדית, תהליכים מטבוליים ואיתות חיסוני.
- אספקת פלטפורמה למחקר פרמקוקינטיקה של תרופות, שטף רכיבי תזונה ותגובות ספציפיות לכבד במצב בריא ובמצב מחלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קנולציה כירורגית של צינור הלימפה הכבדי לדגימה רציפה של זרימה לימפתית החוצה.
- קנולציה של העורק הגרוני לדגימה רציפה של דם עורקי.
- קנולציה של הווריד הג'וגולרי לצורך הידרציה, תמיכה בנוזלים או איסוף דם ורידי.
- דגימה סופית של העורק הכבדי והווריד הפורטלי עם סיום הניסוי להערכת זרימה נכנסת לכבד.
- מדידת קצב זרימת הלימפה הכבדית (~0.1 mL/h) בחולדות תחת הרדמה לאימות תקינות המודל.
תוצאות עיקריות
- קנולציה מוצלחת הניבה זרימה יציבה של לימפה כבדית של כ-0.1 mL/h בחולדות המורדמות.
- דגימה רציפה של לימפה כבדית תוחזקה למשך עד 8 שעות, במקביל לדגימת דם עורקי ומסורי סימולטנית.
- המודל אפשר השוואה ישירה בין דם עורקי (קלט סיסטמי) לבין זרימה לימפתית כבדית יוצאת (פלט שעבר עיבוד בכבד).
- דגימה סופית מהעורק הכבדי ומהורי השער אפשרו הערכה של זרימת חומרים מזינים ותרופות אל הכבד.
- התהליך הקל על ניתוח של פינוי כבדי, טרנספורמציה מטבולית וטיפול במתווכי חיסון.
מסקנות
- מודל חולדה עם קניולציה משולשת מספק מערכת חזקה לדגימה סימולטנית של לימפה הכבדית ושל דם עורקי וורידי.
- הוא מאפשר השוואה ישירה של זרימה נכנסת לכבד, זרימה יוצאת מהכבד וניקוז לימפתי תחת תנאים מבוקרים.
- המודל מתאים לחקר הובלה הכבדית, מטבוליזם, תפקוד חיסוני ופרמקוקינטיקה.
- יישומים כוללים הערכה של פיזור תרופות, שטף חומרים מזינים ותגובות של הכבד במצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים.
- גישה זו משפרת את התובנה המכניסטית לגבי תפקוד הכבד על ידי שילוב של דגימה וסקולרית ולימפטית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דגימה סימולטנית של לימפה ודם כבדיים במודל חולדה מאפשרת הערכה כמותית וישירה של תהליכי הובלה, פינוי ומטבוליזם בכבד, שהם קריטיים לגילוי תרופות ולמחקר תרגומי. פלטפורמה זו מגבירה את הביטחון החזוי בפינוי הכבדי, ובכך תומכת בהסרה מכניסטית של סיכונים ובתיקוף מטרות בנקודות השבחה מרכזיות בשרשרת הפיתוח הביו-פארמצבטית. יכולתו של המודל להשוות בין מדורים עורקיים, ורידיים ולימפטיים מספקת תובנה ברמה ארגונית לגבי תגובות ספציפיות לכבד ופרמקוקינטיקה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה מכניסטית של מסלולי ספיגה, מטבוליזם ופינוי בכבד.
- תומך בתיקוף תפקודי של נשאים כבדיים ומטרות מטבוליות.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין תרומות וסקולריות ללימפטיות לפיזור התרכובת.
- משפר את הביטחון החזוי לגבי סיכונים כבדיים בתיקי פיתוח בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק דגימות ביולוגיות מתוקפות עבור בדיקות כמותיות המשך של מטבוליטים, ציטוקינים וקסנוביוטיקה.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה בין המדורים העורקיים, הורידיים והלימפטיים.
- תומך בזרימות עבודה הניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב להערכת תרכובות בהקשרים כבדיים.
- מכין סטים חסונים של דגימות עבור סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) וגילוי של סמנים ביולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים לפיזיולוגיה כבדית אנושית באמצעות שילוב של דגימות וסקולריות ולימפטיות.
- מאפשרת זיהוי של ביומרקרים תרגומיים באמצעות ניתוח ספציפי למדורים.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכונים על ידי אספקת נתונים מקיפים על פיזור כבדי.
- מסייעת ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של טיפולים המכוונים לכבד.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
מודל זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי תרכיבים מובילים (lead identification) ומחקר פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לניתוח כמותי וישיר של הובלה ומטבוליזם בכבד על פני מדורי כלי דם ומערכת הלימפה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור נתיבים עבור מנגנוני פינוי ותעתוק בכבד.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות ומיון תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדידות רב-מדוריות להשוואה בין זרימה פנימה, זרימה החוצה וניקוז לימפתי.
- מחקר תרגומי: מתאימה ממצאים פרה-קליניים לתהליכים כבדיים רלוונטיים לבני אדם ולפרופילי סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מקים פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מחקרי כבד מגוונים, מפרמקוקינטיקה ועד איתות חיסוני.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי פינוי כבדי.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הדגימה והניתוח במדורי כלי דם ומערכת הלימפה לצורך הדירות (reproducibility).
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות משופרת לגבי המשך פיתוח (go/no-go) ויעילות הון על ידי הבהרה מוקדמת של הסיכון הכבדי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסים המכוונים לכבד.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות כירורגית לצורך קנולציה מדויקת ואיסוף דגימות.
- נשעת תשתית אנליטית למדידה כמותית של מטבוליטים ומולקולות איתות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית לטיפול בדגימות ואינטגרציה של נתונים.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של מחלות ולתנאים ניסיוניים כפי שנתמך על ידי הפרוטוקול.
- נפח הדגימה ומשך הזמן מוגבלים על ידי קצבי זרימת הלימפה והפיזיולוגיה של בעל החיים.
