שיטה משולבת למידול שבץ פוטוטרומבוטי ורישום אופטרודה ב-vivo של פעילות נוירונית ואסטרוציטית בעכברים מתנהגים
29 במאי 2026
פרוטוקול זה מספק שיטה משולבת הכוללת העברת ויראלית, השתלת אופטרודה, השראה פוטותרומבוטית, רישום סימולטני של פעילות אסטרוציטים ונוירונים, וגירוי אופטוגנטי של אסטרוציטים. שיטה משולבת זו שואפת לספק חקירה מקבילה של מערכת היחסים בין האסטרוציטים לנוירון בשלבים החריפים ועד הכרוניים של שבץ איסכמי.
המחקר שלנו מפתח שיטה משולבת להקלטה סימולטנית של פעילות אסטרוציטים ונוירונים במהלך שבץ איסכמי בעכברים בעלי התנהגות. שיטות קודמות הקליטו נוירונים או אסטרוציטים בנפרד. הפרוטוקול שלנו לוכד אותות של אסטרוציטים ונוירונים בו-זמנית, החל מרגעי תחילתו של השבץ.
ראשית, העבירו עכבר C57BL/6J תחת הרדמה עמוקה למסגרת הסטריאוטקסית המצוידת במסכת הרדמה. נטרו את עומק ההרדמה בכל 10 דקות תוך שמירה על טמפרטורת גוף העכבר בין 36 ל-37.5 degrees Celsius באמצעות פלטת חימום עם בקרת משוב. קבעו את העכבר למסגרת הסטריאוטקסית בעזרת מוטות אוזניים ומוט פה, לאחר מריחת משחה אופתלמית בעיניים.
יש לאשר את קיבוע הראש באמצעות בדיקה עדינה לאחר שהראש קובע באופן סימטרי. לאחר הסרת שיער והכנה ספטית של העור, השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך בקו האמצע. נקה את הפריוסטום (perioisteum) באמצעות תמיסת סלין ומקלונים של צמר כדי לחשוף את ה-bregma וה-lambda.
הורד את המיקרופיפט מזכוכית כך שיגע ב-bregma וב-lambda לסירוגין. לאחר רישום קואורדינטת ה-Z במד הוורנייר הדיגיטלי, כוונן את מוט הפה עד שההפרש יהיה קטן מ-0.04 millimeters. הורד את המיקרופיפט מזכוכית כך שיגע ב-bregma ואפס את מד הוורנייר הדיגיטלי.
הזיזו את המיקרופיפט 2.3 מילימטרים שמאלה וימינה ביחס ל-bregma לסירוגין. לאחר רישום קואורדינטת ה-Z, כווננו את מוטות האוזן עד שההבדלים הבילטרליים יהיו פחות מ-0.04 מילימטרים. לאחר איפוס של הסרגל הדיגיטלי (vernier) ב-bregma, סמנו את אזור הגפה הקדמית של קליפת המוח המוטורית במיקום anterior posterior פלוס 1.5 מילימטרים ו-medial lateral פלוס 0.74 מילימטרים.
השתמשו במקדח מיקרו ובמקדחים עם ראש עגול בקוטר 0.5 מילימטר כדי לקדוח חור קטן, בקוטר של כ-0.5 מילימטר, במיקום המסומן. לפני ההזרקה, ערבבו את שני הווקטורים של הווירוס האסוציאטיבי-אדנו (adeno-associated viral vectors) בנפחים שווים וסבבו את הדגימה במערך צנטריפוגה לזמן קצר. הורידו את מיקרופיפטת הזכוכית המחוברת למשאבת המיקרו-אינפוזיה לאתר היעד בעומק דורסלי-ונטרלי של 0.94- מילימטרים מפני השטח של המוח.
הזרימו 400 ננוליטרים של התערובת הנגיפית המכילה 200 ננוליטרים מכל וקטור, בקצב של 50 ננוליטרים לדקה. הוציאו את הפיפטה באיטיות 10 דקות לאחר השלמת ההזרקה. תפרו את קרקפת הראש באמצעות תפר 4-0 באורך 20 מילימטרים, עיגול 3/8, והניחו את העכבר על פד חימום עד להחלמה מלאה.
שלושה עד ארבעה שבועות לאחר ההזרקה הוויראלית, בצעו את הפרוצדורה שהודגמה בעבר עד לשלב החתך בקרקפת. במהלך החתך בקרקפת, הסירו שטח של 1.5 סנטימטרים על 1.5 סנטימטרים מהקרקפת, תוך שמירה על מספיק עור מסביב לעיניים. נקו את הגולגולת בעזרת hydrogen peroxide ותמיסת saline 0.9%.
לאחר זיהוי ה-bregma, אפס את הפניר הדיגיטלי. השתמש במקדח עם קצה עגול בקוטר 0.8 millimeter כדי להחשין קלות את פני הגולגולת. סמן את אזור הגפיים הקדמיות בקליפת המוח המוטורית.
במימד הקדמי-אחורי, 1.5 מילימטרים ובמימד המדיאלי-לטרלי 0.74 מילימטרים. השתמשו בסימון כנקודת המרכז כדי לצייר ריבוע של חמישה מילימטרים על חמישה מילימטרים. השתמשו במקדח מיקרו במהירות של כ-10,000 סיבובים לדקה כדי לחצוב את הריבוע.
יש להחיל באופן רציף תמיסת מלח קרה מאוד (בטמפרטורת קרח) למסלול הקידוח ולהפסיק מיד אם המגף העשמי (bone flap) מתרופף. קדחו שלושה חורים קטנים בקוטר 0.5 millimeter מעל ההמיספירה הנגדית והמוחון. השתילו ברגי קרניופלסטיה (cranioplasty screws) לתוך החורים.
יש לוודא שכל בורג מגיע עד לקרום העמי (dura mater) אך לא חודר מעבר לכך, כדי למנוע נזק לרקמת המוח. השתמשו בפינצטה כדי להסיר את לשונית העצם שהשתחררה. השתמשו בפינצטה עדינה במיוחד עם חוד הקטן מ-0.03 מילימטרים על 0.01 מילימטרים כדי להסיר את הקרום העמי בחלון הגולגולת, תוך הימנעות ממגע ישיר עם רקמת המוח.
קבעו את האופטרודה (optrode) לזרוע המיקרו-מניפולטור של המסגרת הסטריאוטקסית והזיזו אותה מעל לחלון הגולגולת. שלבו בבטיחות את חוטי ההארקה והייחוס מ keperluan הכסף של האופטרודה עם שלושת ברגי הקרניופלסטיה. נקו את פני השטח של חלון הגולגולת באמצעות סלין סטרילי.
הורד לאט את ה-optro לעומק הגבי-בטני (dorsal-ventral) הרצוי של 0.94- מילימטרים, בקצב של מילימטר אחד ל-10 שניות. לאחר ההשתלה, מרח שכבת אגרוז מעל החלון הגולגולתי. מרח שלוש עד ארבע שכבות של דבק שיניים.
לאחר שהצמנט הדנטלי מתמצק, יש לספק אלגזיה למשך שלושה עד חמישה ימים ולאפשר לעכבר להתאושש במשך שבוע עד שבועיים. השתמשו במערכת פוטומטריה של סיבים בעלת שני או שלושה אורכי גל כדי לעורר את GCaMP6s. הגדירו את ערוץ האות ל-470 nanometers ואת ערוץ הבקרה ל-410 nanometers.
כוון את קצב הדגימה ל-60 פריימים לשנייה. כעת, הארקה של כל רכיבי מערכת ההקלטה באופן תקין. השתמש במחייש median משותף במהלך ההקלטה.
וודאו כי אותות ה-wide band וה-local field potential נבחרים בתוכנת ההקלטה, תוך ניטור רעשים לאורך כל סשן ההקלטה. לאחר הרדמה קצרה של העכבר, חברו את ה-optro לקו ההקלטה באמצעות מתאם. מקמו את העכבר בסביבה הדומה לכלוב בית עבור ההקלטה.
אפשרו 10 דקות של אקלימציה לאחר היקיצה. הקליטו את העכבר בעת ביצוע בדיקת כוח אחיזה (grip strength test), הדורשת משיכה אחת לדקה למשך חמש דקות. סמנו את זמן התרחשות הבדיקות ההתנהגותיות בדיוק רב הן במערכות הרב-ערוציות והן במערכות הפוטומטריה של סיבים.
החדירו פתרון צבע Rose Bengal בריכוז 1.5% באופן תוך-פריטוני (intraperitoneally) במינון של 10 עד 20 מיליגרם לקילוגרם והמתינו חמש דקות. לאחר השגת אלחוש עמוק ושמירתו, חברו את פרוב האופטרוד (optrode) למקור הלייזר. הפריצו קרן לייזר באורך גל של 530 ננומטר בעוצמה של 15 מיליוואט דרך האופטרוד המושתל למשך חמש עד שמונה דקות כדי להשריות איסכמיה מוקדית.
כדי לבצע גירוי אופטוגנטי, חברו את ממריץ הלייזר לאופטרודה. הפעילו את ממריץ הלייזר האופטוגנטי ב-488 nanometer וכווניו ל-10 milliwatts למשך חמש דקות עבור Opto-vTrap. לבסוף, הניחו את העכבר על משטח חימום להתאוששות.
בהשוואה למצב הבסיס, זרימת הדם המוחית ירדה לאחר פוטו-תרומבוזה ונותרה מדכאת יום אחד ושבעה ימים לאחר השבץ. כוח האחיזה של הגפה הקדמית הראה ירידה מובהקת מאוד ביום הראשון ונותר מדכא שבעה ימים לאחר השבץ. תנודות הסידן האסטרוציטיות שנמדדו באמצעות פוטומטריה של סיבים ופעימות עצביות מאלקטרופיזיולוגיה סונכרנו על בסיס חותמות זמן.
בעקבות שבץ פוטו-תרומבוטי, שיעורי הפריקה דוכאו באופן משמעותי הן בנוירונים פירמידליים והן בנוירונים אינטר-נוירונליים, בהשוואה לפריקה הבסיסית במהלך משימת האחיזה של הגפה הקדמית. במצב הבסיס, תנודות הסידן האסטרוציטיות הגיעו לשיאן תוך ארבע עד שש שניות מתחילת המשימה. אך האמפליטודה פחתה באופן משמעותי לאחר השבץ הפוטו-תרומבוטי, מה שמשקף פעילות סידן מוחלשת.
תרשימי רסטר (Raster plots) והיסטוגרמות זמן סביב גירוי (peri-stimulus time histograms) הראו שינויים בפעילות הנוירונלית במהלך גירוי אופטי. קצבי הפריקה הן של הנוירונים הפירמידליים והן של הנוירונים המעכבים (interneurons) הראו ירידה משמעותית לאחר הגירוי האופטי בהשוואה לקו הבסיס לפני הגירוי, מה שמאשר שלמודולציה של אסטרוציטים יש השפעה מדידה במורד הזרם (downstream effect) על עירור המעגל המקומי. פרוטוקול זה מאפשר הקלטה רצופה של פעילות עצבית ותרגול לאורך ציר הזמן של שבץ מוחי קדמי, החל מהסימנים החריפים ועד לשלב הכרוני.
ההצלחה בפרוטוקול זה תלויה ביישור מדויק או מתואם. השתלה של optro מונוקולרית וזמני ביטוי נגיפיים מספיקים לאורך הניתוחים. מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בהשתלות מרובות כדי לנטר אזורי מוח רחבים יותר או לכוון לסוגי תאים שונים באמצעות בדיקות התנהגותיות מגוונות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שיטה משולבת לחקר אינטראקציות בין אסטרוציטים לנוירונים בעקבות שבץ איסכמי בעכברים ערים ופעילים. באמצעות שילוב של השראת שבץ פוטוטרומבוטית עם אלקטרופיזיולוגיה רב-ערוצית סימולטנית ופוטומטריה של סיבים אופטיים באמצעות אופטרודה מותאמת אישית, גישה זו מאפשרת הקלטות רב-מודליות בזמן אמת של פעילות נוירונלית ואסטרוציטית במהלך משימות התנהגותיות. השיטה פותרת מגבלות של טכניקות קודמות בכך שהיא מאפשרת השראה, הקלטה ומניפולציה אופטוגנטית בו-זמנית ללא צורך בניתוחים מרובים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- מחקר שבץ מוחי
- אלקטרופיזיולוגיה
- אופטוגנטיקה
רקע
- דינמיקה של אסטרוציטים ונוירונים היא קריטית להחלמה לאחר שבץ מוחי.
- לשיטות קיימות חסרה לעיתים קרובות היכולת לנטר אינטראקציות בזמן אמת במהלך התנהגות.
- קשה לחקור פתולוגיה של שבץ מוחי בשלב החריף באמצעות גישות מסורתיות.
- הקלטה ומניפולציה סימולטניות של שני סוגי התאים בבעלי חיים מתנהגים הן מאתגרות מבחינה טכנית.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול להקלטה רב-מודאלית בזמן אמת של פעילות אסטרוציטים ונוירונים לאחר שבץ מוחי.
- מתן אפשרות לחקירת שלבים חריפים וכרוניים של שבץ מוחי בעכברים בעמידה בתפקוד התנהגותי.
- תיקוף יכולתו של המערכת להפעיל ולנטר אינטראקציות בין אסטרוציטים לנוירונים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- השראה פוטותרומבוטית של איסכמיה מוקדית בקליפת המוח של עכבר.
- אלקטרופיזיולוגיה רב-ערוצית סימולטנית להקלטת פולסים עצביים (spikes).
- פוטומטריית סיב לניטור תנודות סידן באסטרוציטים.
- אופטרודה מיוצרת בהתאמה אישית לפוטותרומבוזה, הקלטה ומניפולציה אופטוגנטית בו-זמנית.
תוצאות עיקריות
- הקלטה סימולטנית מוצלחת של אותות סידן באסטרוציטים ושל פריקה עצבית בעכברים ערים ובמצב התנהגותי.
- סטימולציה אופטוגנטית של אסטרוציטים הובילה להפחתות מדידות בתדירות הפריקה הן של נוירונים פירמידליים (ב-1.55 ± 0.45 Hz) והן של אינטרנוירונים (ב-3.64 ± 1.37 Hz; n = 2).
- המערכת מאפשרת חקירה של אינטראקציות בין אסטרוציטים לנוירונים בזמן אמת במהלך משימות התנהגותיות.
- תוצאות מייצגות מתקפות את הגישה המשולבת למחקר שבץ מוחי.
מסקנות
- הפרוטוקול ממלא פער מתודולוגי קריטי במחקר על שבץ מוחי.
- הוא מאפשר חקירה רב-מודאלית בזמן אמת של אינטראקציות תאיות משלבים חריפים ועד לשלבים כרוניים של שבץ.
- הגישה מקלה על מחקר של דינמיקה בין אסטרוציטים לנוירונים במהלך התנהגות, ובכך מקדמת את ההבנה של מנגנוני ההחלמה לאחר שבץ.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
בחינה רב-מודאלית בזמן אמת של אינטראקציות בין אסטרוציטים לנוירונים בבעלי חיים מתנהגים נותנת מענה לפער קריטי במחקר פרה-קליני של שבץ מוחי. שיטה משולבת זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור מסלולים נוירו-וסקולריים ונוירו-דלקתיים. הגישה תומכת ברציפות תרגומית משלבים חריפים לשלבים כרוניים של שבץ, ובכך מסייעת בקבלת החלטות לגבי פורטפוליו של גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של היפותזות על אינטראקציה נוירו-גליאלית במודלים רלוונטיים למחלה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור בין מודולציה של אסטרוציטים לשינויים בפלט הנוירונלי.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות עבור מסלולי איתות של אסטרוציטים ונוירונים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספקת פלטפורמה מתוקפת לקבלת מדדים כמותיים וסימולטניים של פעילות נוירונלית ואסטרוציטית.
- מאפשרת הערכה ניתנת לשחזור של התערבויות פרמקולוגיות או גנטיות בזמן אמת.
- תומכת בסטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך סריקה בתוכן גבוה (high-content screening) של תרכובות נוירו-אקטיביות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים למכניזמים רלוונטיים למחלה בבני אדם על ידי לכידה של דינמיקות של שבץ חריף וכרוני.
- מאפשרת מחקרים אורך של השפעות התערבות על אינטראקציות תאיות במהלך התנהגות.
- משפרת את קידומו של הפיתוח בתיקון סיכונים על ידי אספקת ביומרקרים רב-מודאליים וניבויים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לבין התיקוף הפרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לניתוח בזמן אמת, in vivo, של דינמיקה נוירו-גליאלית לאחר שבץ בעכברים בעלי התנהגות תקינה.
- ביולוגיה גילויית: תומכת בבדיקת השערות לגבי איתות בין אסטרוציטים לנוירונים וביסוף מסלולים לאחר פגיעה איסכמית.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך סריקת תרכובות או סריקה גנטית בהקשר פיזיולוגי רלוונטי.
- אנליטיקה: מספקת נתוני אלקטרופיזיולוגיה ודימויי סידן בו-זמנית להשוואה סטטיסטית חסונה של השפעות ההתערבות.
- מחקר תרגומי: מקלה על התאמת ממצאים פרה-קליניים עם נקודות קצה קליניות על ידי מידול של שלבי שבץ חריפים וכרוניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר למודלים מגוונים של מחלות CNS הדורשים בחינה רב-מודאלית בזמן אמת.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות נוירו-וסקולריות.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימת העבודה על ידי שילוב של אינדוקציה, הקלטה ומניפולציה בפרוצדורה אחת.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) באמצעות נתונים חסונים בעלי רלוונטיות תרגומית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של נכסי CNS על ידי אספקת תוצאי קריאה בעלי תוכן גבוה ורלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה in vivo, פוטומטריה של סיבים (fiber photometry) ואופטוגנטיקה.
- דורש מכשור ייעודי, כולל אופטרודות (optrodes) מותאמות אישית ומערכות הקלטה מסונכרנות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולים של רכישת נתונים וניתוחם.
- התאמה למודלים אחרים של מחלות במערכת העצבים המרכזית (CNS) עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות מורכבות טכנית והצורך באימון התנהגותי של מודלים של בעלי חיים.
