מערכת מיקרופלואידית למידול תפקוד לקוי של האנדותל תחת מאמץ גזירה פיזיולוגי פועם והיפרגליקמיה אוסצילטורית

מחקר זה בוחן כיצד היפרגליקמיה תנודתית מסונכרנת ומתח גזירה פועם יחד מניעים תפקוד לקוי באנדותל במחלות כלי דם סוכרתיות. המודלים הקיימים משתמשים בזרימה התחלתית של רמות סוכר גבוהות או זרימה למינרית יציבה. אנו חוקרים כיצד עומס גזירה פועם מתמודד עם פגיעת גלוקוז תנודתית.

כדי להתחיל, השתמש בתוכנת תכנון בעזרת מחשב לעיצוב מבנה השבב המיקרופלואידי. תייצר את התבנית הראשית של SU-8 דרך חברה מסחרית. בכוס ערבוב נקייה, ערבבו את חומר הקיבוש פולידימתילסילוקסן ואת הפולימר המקדים ביחס של 10:1 למשקל וערבבו ביד בעוצמה במשך חמש דקות.

לאחר מכן הניחו את המיכל בתא ואקום בלחץ של 0.08 מגה-פסקל למשך לפחות 15 דקות כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו במהלך הערבוב. שופכים את הפולידימתילסילוקסן על הוופר המונח בצלחת פטרי מזכוכית. דה-גז, הפולידימתילסילוקסן נשפך על הוופר במייבש למשך 15 דקות נוספות כדי להסיר בועות שנוצרו במהלך היציקה.

הניחו את צלחת הפטרי המכילה את התבנית והפולימר בתנור חם עם טמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. באמצעות סכין מנתח, קילפו בזהירות את המשטח הפולימרי המוצק מהתבנית הראשית. באמצעות כלי ניקוב ליבה, צור פתחי כניסה ויציאה בקצוות התעלה המיועדים על לוח הפולימר.

נקה את שכבת הזכוכית ואת המשטח המעוצב של לוח הפולימר עם דבק דבק. לאחר מכן, טפלו גם בלוח הפולימר וגם במשטח הזכוכית עם מנקה פלזמה בעוצמה של 65 וואט באוויר החדר למשך 60 שניות. מיישר מיד את פני תעלת הפולימר עם הצד המטופל של כיסוי הזכוכית.

לאחר מכן לחץ בעדינות ליצירת ערוץ מיקרופלואידי סגור לצמיתות. הניחו את שבב המיקרופלואיד המחובר בבקבוק זכוכית בורוני מלא במים דה-יוניים. סטריליזציה על ידי אוטוקלבינג בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ו-15 פאונד לאינץ' רבוע למשך 20 דקות.

הניחו את השבב המעוקר בצלחת תרבית בקוטר 60 מ"מ מלאה בתערובת אקווימולרית של PBS ו-DMEM דל סוכר. לאחר מכן, באמצעות מזרק של מיליליטר אחד, מכניסים 100 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין לתעלה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. לאחר מכן, הוסיפו 24.5 מילימולר דמניטול ל-DMEM נמוך סוכר כדי להעלות את הלחץ האוסמוטי.

הוסף חמש מילימולר D-גלוקוז ל-DMEM עם גלוקוז גבוה כדי לקבל ריכוז סופי של 30 מילימולר גלוקוז. הכינו תרבית גלוקוז רגילה במידה בינונית וגבוהה עם תוספת של 20% FBS ו-1% פניצילין סטרפטומיצין. לאחר מכן PBS חמים, טריפסין, מדיום תרבית גלוקוז רגיל, ומדיום תרבית גלוקוז גבוה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

קצור את תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי מהצלחת התרבית ב-90% מזל. נתק את התאים באמצעות תמיסת 0.25% trypsin-edta. לאחר דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ספרו את התאים שנקטפו והשאירו אותם מחדש בנפרד במדיות גלוקוז רגילות ובמדיות גבוהות גלוקוז בריכוז של 1 כפול 10 לכוח של 6 תאים למיליליטר.

באמצעות מזרק של מיליליטר אחד, הזרקו 100 מיקרוליטר של תליית התא לפתח הכניסה של שבב המיקרופלואיד, עם מדיום גלוקוז רגיל לקבוצת הביקורת ומדיום גלוקוז גבוה לקבוצת הניסוי. הניחו את שבבי המיקרופלואיד באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 48 שעות. חשב את קצב הזרימה הנדרש להשגת מאמץ גזירה פולסיטי היעד באמצעות המשוואה שהוצגה.

חבר את מקור הלחץ לבקר הלחץ. לאחר מכן חבר את בקר הלחץ לבקר השסתומים שמחובר למחשב לשליטה אוטומטית על צורות גלי לחץ. מלא שני מאגרים של 100 מיליליטר, אחד במדיום תרבית סוכר רגיל והשני במדיום תרבית סוכר גבוה.

חבר את המאגרים לערוצים המתאימים של בקר הלחץ. לאחר מכן מחברים את המאגרים ואת השסתום המגנטי התלת-כיווני הדו-מצבי באמצעות צינורות סיליקון. קבע את המאמץ הגזירה הפיזיולוגי הפועם המתאים לקצב זרימה של כ-200 מיקרוליטר לדקה.

תכנת את משאבת האוויר המתוכנתת ליצירת פונקציית גל סינוס לשמירה על מתח הגזירה הפולע. לאחר מכן, תכנת את בקר השסתום להחליף ערוצים כל חמש דקות כדי ליצור תנודת גלוקוז בגל ריבועי במהלך גירוי דינמי. קשר בין השסתום המגנטי התלת-כיווני הדו-מצבי לשבב המיקרופלואידי באמצעות צינורות סיליקון.

לאחר מכן הפעל את מערכת המשאבות המתוכנתת כדי להכין את הצינור. לאחר מכן, באמצעות מחברי נירוסטה בקוטר 1.3 מילימטר בזווית של 90 מעלות, מחברים את יציאות הכניסה והיציאה של שבב המיקרופלואיד לצינור. חבר את יציאת השבב המיקרופלואידי למאגר הפסולת, ואז הפעל מחדש את המשאבה כדי לספק שילוב של גלוקוז אוסצילטורי ומתח גזירה פועם למשך סך של 30 דקות.

לאחר ביצוע אימות שדה זרימה, יש להכין את תמיסת העבודה של הקלצין AM ופרופידיום יודיד לפי הוראות היצרן בנקודת הניסוי. לאחר שהתעלה נשטפת פעם אחת עם PBS, הכנס לתעלה את תמיסת העבודה של הקלצין AM ופרופידיום לתוך התעלה ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 30 דקות בחושך. ללכוד מיד תמונות פלואורסצנטיות של התאים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד בעדשה אובייקטיבית פי 10.

לצלם מיד תמונות פלואורסצנטיות של התאים המוצבעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד בעדשה אובייקטיבית של 10x. השתמשו במסנן ירוק פלואורסצאין איזותיוציאנאט לקלסין AM ובמסנן טטרמתילרודאמין או רודמין אדום עבור פרופידיום יודיד. לאחר שטיפת הערוץ שלוש פעמים עם PBS, הכנס לתעלה את תמיסת הגשוש הפלואורסצנטי של מתח חמצוני של תא חי ותדגור כפי שהודגם קודם.

שטוף את הערוץ שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את הגשש הלא קשור. לצלם מיד תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מסנן אדום רחוק דרך עדשת אובייקטיב 20x, תוך שמירה על פרמטרי חשיפה זהים בכל הקבוצות. פתח את התמונות האדומות של הקלצין AM Green ו-Propidium Yodide ב-ImageJ.

כוונן ידנית את הסף לכל ערוץ כדי להבחין בין אותות פלואורסצנטיים לרקע. השתמש במונה התאים כדי לכמת תאים פלואורסצנטיים, תוך התאמת גודל התא המינימלי בהתבסס על תצפיות כדי לקבוע ספירת תאים חיים ומתים בשדות ראייה מרובים. חשב את אחוז התאים החיים באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני לכל מצב ניסוי.

לאחר מכן מחשבים את הממוצע והסטיית התקן בין מספר תחומי ראייה באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי להשוואת קבוצות. גרור את התמונה המועדפת ל-ImageJ. בחר בניתוח ובחר Set Scale כדי לכייל את גודל הפיקסל באמצעות המטא-דאטה של המיקרוסקופ.

לאחר מכן הסר את אות הרקע האחיד הלא ספציפי מכל התמונה באמצעות פונקציית החיסור ברקע על ידי בחירת תהליך ובחירה ב-Subtract Background. לאחר מכן, בחר תמונה, בחר בהתאם, ואחריו סף כדי לכוון ידנית את מחוון הסף ולהגדיר את אות מיני החמצן הריאקטיביים התוך-תאיים. הגדר את המדידות על ידי בחירת ניתוח ובחירת הגדר מדידות שיכללו שטח וערך אפור ממוצע.

Select Analyze and Analysis חלקיקים כדי לקבוע את גודל התא המינימלי בהתבסס על ממדי התא שנצפו ומדידת עוצמת האות הממוצעת במקטע בתוך ROI של שכבת התא החד-שכבתית. דווח על רמת מיני החמצן הריאקטיבי עבור כל מצב ניסויי כממוצע הערכים הנמדדים שמקורם לפחות בשלושה שדות ראייה שנבחרו באקראי לכל שבב. הזן את התוצאות הכמותיות לתוכנות ניתוח נתונים וגרפים.

קבעו מובהקות סטטיסטית על ידי השוואת קבוצות ניסוי עם קבוצת הביקורת באמצעות ניתוח שונות דו-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי ברמת מובהקות של 0.05. השתמש בתוכנה לביצוע הניתוח וליצור גרפים עם פסי שגיאה המייצגים סטיית תקן. תמונות פלואורסצנציה מייצגות הראו שיעור גבוה של תאים ברי קיימא בכל הקבוצות, עם מוות תאי זניח שנצפה בקבוצות גלוקוז נורמלי וגלוקוז תקין עם מאמץ גזירה פועם, בעוד שקבוצות הגלוקוז האוסצילטורי והגלוקוז התנודתי עם עומס גזירה פועם הראו עלייה נראית לעין בתאים מתים.

ניתוח כמותי הראה שחשיפה לגלוקוז תנודתית הביאה לירידה משמעותית בחיוניות התאים בהשוואה לקבוצת הביקורת, ויישום לחץ גזירה פועם בתנאי גלוקוז תנודתיים העלה משמעותית את החיוניות בהשוואה לגלוקוז תנודתי בלבד. בתנאי גלוקוז רגילים, רמות מיני חמצן תגובתי תוך-תאית היו נמוכות וירדו עוד יותר לאחר הפעלת מאמץ גזירה. לעומת זאת, תנאי גלוקוז תנודתיים גרמו לעלייה ניכרת בעוצמת הפלואורסצנציה האדומה, מה שמעיד על עלייה בסוגי חמצן תגובתיים.

העלייה התנודתית שנגרמה על ידי גלוקוז בסוגי חמצן תוך-תאי הופחתה לאחר הפעלת מאמץ גזירה. ניתוח כמותי גילה שלחץ גזירה הפחית משמעותית את רמות מיני החמצן הפעילים בתנאי גלוקוז רגילים. לעומת זאת, מצבי גלוקוז תנודתיים הובילו לעלייה משמעותית ברמות מיני חמצן תגובתי בהשוואה לגלוקוז תקין.

יתרה מזאת, לחץ גזירה הפחית משמעותית את רמות סוגי החמצן הריאקטיביים, אפילו בתנאי גלוקוז תנודתיים. פרוטוקול זה מאפשר לכמת את רמות ROS ואת זמינות התאים כדי לחקור תפקוד לקוי של האנדותל תחת היפרגליקמיה תנודתית ומתח גזירה פועם. לאחר הליך זה, ניתן לבצע ניתוח מולקולרי, כגון מסלול NRF2 או איתות iNOS, כדי להוציא את מנגנוני ההגנה האנדותליים.

מחקר עתידי עשוי להשתמש במערכת זו כדי לחקור מסלולים מכנוביולוגיים, לשלב גאומטריות זרימה מופרעות או תרכזת תאי שריר חלק.