4 באוגוסט 2026
מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר מדידת פלואורסצנציה כמותית לאורך החיים של גשושי ריבוגלו עבור תהליכי דימות RNA ניתנים לשחזור במבחנה, בתאי יונקים חיים, ובמודלים תלת-ממדיים תלת-ממדיים. אנו מתכננים תהליכי הכנת דגימות, אספקת גשושים, איסוף נתונים וניתוח כמותי להפקת מדידות חיים של פלואורסצנציה בלתי מוטה.
המחקר שלנו מתמקד בהדמיית RNA בתאים חיים כדי לחקור את הדינמיקה המרחבית-זמנית של RNA. פלטפורמת Riboglow משתמשת במיפוי זמן חיים של פלואורסצנציה כמותי בתאים רב-תאיים החלים על מערכות ביולוגיות בבריאות ובמחלות. ראשית, השג את דגימות ה-RNA או את התאים עם בדיקות Riboglow טעונות בחרוזים.
הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלי עם סריקת לייזר ואחריה יחידת בקרת המיקרוסקופ. הפעל את מערכת מיפוי זמן חיים של פלואורסצנציה או FLIM המבוססת על ספירת פוטונים בודדים מתואמת זמן, כולל יחידת שילוב הלייזר, גלאי הכפלת הפוטונים ושעון האירועים. לאחר פתיחת תוכנת רכישת ותיקון התמונות של NIS, תחת חלון ההגדרה והתצורה, בחר AX עם PicoQuant.
לאחר שהתוכנה הורדה, בחר AX FLIM ו-FCS. כדי להגדיר את המיקרוסקופ לרכישת נתוני זמן חיים של פלואורסצנציה, וודא ש-Galvano נבחר בקטע AX pad. הגדר את ערך הממוצע ל-1 ושהה את זמן ההמתנה ל-2.
בקטע כוח הלייזר, הנמיך את מחוווני הלייזר הבודדים ל-3 עד 4%. הגדר את מחוווני הלייזר הכלליים לאחד. לאחר בחירת העדשה 20X, בהגדרות אזור הסריקה, בחר 512 על 512 והפעל את הגלאים. כדי להגדיר את נתיב קובץ הנתונים, עבור לתחתית קטע הבקר ובחר הגדרה.
לאחר לחיצה על הכרטיסייה PicoQuant או FLIM FCS, תחת נתיב סביבת העבודה, בחר את סמל התיקיה מימין. במיקום האחסון, צור תיקיה חדשה לניסויים לאותו היום וסגור את חלון ההגדרה. לאחר בחירת live והצגת חלון רכישת התמונות, בחר שוב live כדי להשהות את איסוף הפוטונים.
כדי להגדיר חלונות לאיסוף נתונים של מיפוי זמן חיים של פלואורסצנציה או FLIM, לחץ לחיצה ימנית על חלון התמונה החיה ובחר בתוסף PicoQuant. הפעל הצגת עקומת ריקבון, הצגת עקבת זמן והצגת סטטיסטיקת FLIM. כדי להגדיר את סידור הלייזר לניסוי התאי, עבור להגדרות הניסוי בפינה השמאלית העליונה של הדף ליד הלייזרים.
לאחר לחיצה על הוסף ליד תיבת הצבע הרב-ערוצי, הוסף את הצבעים הרצויים. בחר מצב מומחה. התאם את הקצאת הגלאים לכל ספקטרום פליטה.
הפנה ספקטרום עירור ופליטה חופפים לגלאים שונים. בלוח השמאלי, התאם את סדר המעבר כדי למזער את ההפרעה בין צבעים עם ספקטרום עירור ופליטה חופפים. לאחר שמירה ושם התצורה החדשה של הלייזר, בחר את התצורה השמורה לניסוי.
לחץ לחיצה ימנית על חלון הרכישה החי. בחר בקרת רכישה ולאחר מכן בחר סקירת XYZ. לפני טעינת צלחת תרבית התאים להדמיה ל-FLIM, הוסיף את צבע הגרעין של התאים החיים וערבב אותו היטב על ידי סיבוב עדין על הכיור והניח לצד למשך 30 שניות.
הנח את צלחת ההדמיה על במת המיקרוסקופ. דחף את הצלחת לפינה השמאלית התחתונה של במת המיקרוסקופ. הדבק את הדגימה לבמה בעת שימוש בעדשות שאינן אוויר כדי למנוע סטייה XY.
עבור לערוץ 4'6-דיאמידינו-2-פנילאידולי או DAPI. השתמש בכפתור הבקר עד שגרעיני התא יגיעו לפוקוס. במידת הצורך, התאם את רגישות כפתור גובה Z ואם התאים אינם מופיעים בתצוגה, התאם את קואורדינטות ה-XY.
כדי להפעיל את מערכת הפוקוס המושלם או PFS האוטומטי, בצד הימין של לוח AX, בחר את זכוכית המגדלת ליד כפתור ה-PFS. לאחר שהמיקרוסקופ נרמל אוטומטית את גובה Z, וודא שכפתור ה-PFS מאיר ומציג פוקוס. באמצעות גלאי AX, מצא את התאים הרצויים באמצעות ערוץ DAPI.
לאחר מכן עבור לערוץ ATO 590 כדי לזהות באופן יעיל תאים טעונים בחרוזים. לאחר זיהוי תא ומרכזו על ידי לחיצה כפולה, עבור ל-AX FLIM ו-FCS. וודא ש-512 על 512 נבחר, התאם את גודל המסגרת על ידי לחיצה וגרירת הפינות כך שתתאים לתא.
א
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור Riboglow-FLIM, מערכת חיישן ביולוגי של RNA המקודדת גנטית, המאפשרת ויזואליזציה כמותית של מולקולות RNA בתאי יונקים חיים באמצעות מיקרוסקופיית דימות זמן חיים של פלואורסצנציה (FLIM). זרימת העבודה כוללת הכנת דגימות, רכישת תמונות וניתוח כמותי, ובכך מסייעת לחקר הדינמיקה והאינטראקציות של RNA הן בסביבות מבוקרות והן בתאים חיים.
ויזואליזציה כמותית של RNA בתאי יונקים חיים מהווה אתגר קריטי בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות, ובמיוחד להבנת הדינמיקה של RNA לא מקודד ומנגנוני בקרה. תהליך העבודה של Riboglow-FLIM מאפשר מדידה חסונה וניתנת לשחזור של לוקליזציית RNA ואינטראקציות בסביבות תאיות מורכבות, ובכך תומך בביטחון חיזוי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים. יכולת זו מחזקת את הרצף התרגומי משלב הגילוי ועד למחקר פרה-קליני, על ידי אספקת נתוני RNA כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית.
פרוטוקול ה-Riboglow-FLIM משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אפשור דימוי כמותי של RNA, החל מתיקוף in vitro ועד לניתוח תאים חיים ומודלים תלת-ממדיים.