בדיקת הגנה על אמיקצין לכימות והדמיה של פלישת תאי אשריכיה קולי

אנו מתמקדים באפיון האופן שבו E.coli פולשני דבק חודר לתאי אפיתל במעי ובזיהוי גורמים חיידקיים התורמים לתהליך זה. מבודדים עמידים לגנטמיצין מגבילים בדיקות פלישה מסורתיות. פרוטוקול מבוסס אמיקאסין זה מאפשר כימות מדויק של חיידקים תוך-תאיים.

כדי להתחיל, אסוף את כל החומרים והמדיה הנדרשים לבדיקת הפלישה. לאחר מכן, שלפו את מלאי הגליצרול הקפוא של זן Escharicia colli (AIEC) הפולש הדביק ממקפיא 80 מעלות צלזיוס. באמצעות מקל עץ סטרילי או קצה פיפטה, גרדו בעדינות חיידקים מהגבעול ומרחו אותם על צלחת בורח Luria-Bertani או LB כדי לקבל מושבות בודדות.

דגור את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת, באמצעות מקל עץ סטרילי או קצה פיפטה, קטף מושבה אחת מהצלחת המקדח. החסן את המושבה ב-3 מיליליטר של מרק LB ודוגר את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-200 סיבובים לדקה במהלך הלילה.

לאחר מכן מבצעים דילול של 1 עד 10 של התרבית הלילית ב-1 מיליליטר של מרק LB. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר של התרבית המדוללת באמצעות ספקטרופוטומטר. העבר 100 מיקרוליטר מהתרבית הלילית לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר ובצנטריפוגה בטמפרטורה של 6,000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

שאפו את הסופרנטנט בזהירות מבלי להפריע לכדור התא ותלו מחדש את הכדור ב-1 מיליליטר של סרום ומדיה נטולת אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית. חשב את נפח ההשעיה החיידקיים הנדרש כדי להשיג ריבוי זיהום או MOI של 10 באמצעות הנוסחה שסופקה. להכנת מדיום הזיהום, העבר את נפח ההדבקה החיידקי לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מיליליטר וממלא את הנפח ל-1 מיליליטר עם סרום ומדיה ללא אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית.

ערבב בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. הכינו פלטת 96 בארות לקביעת יחידות היווצרות מושבה למיליליטר של תרבית חיידקים מדוללת במהלך הלילה על ידי ביצוע דילול סדרתי פי עשרה ב-PBS סטרילי 1X. העבר 200 מיקרוליטר מהתרבית המדוללת ללילה אל הבאר הראשונה של הצלחת.

פיפט 20 מיקרוליטר של התרבית לשורה הבאה המכילה 180 מיקרוליטר של 1X PBS. ערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים וחזרו על תהליך הדילול עד שמגיעים ל-10 עד הספק של 6 עם קצה פיפטה חדש בכל פעם. עכשיו פלטה של 10 מיקרוליטרים של דילול נקודתי בשלושה עותקים מ-10 להספק של 2 עד 10 ועד 6 דילול על לוחות מקדח LB.

תן לנקודות להיספג לתוך המקדח ליד הלהבה. דגרו את הלוחות במהלך הלילה בטמפרטורה של 27 עד 30 מעלות צלזיוס כדי למנוע צמיחת יתר של מושבות ולקבל מושבות בודדות נקיות. הסר את שכבות המונוליי האפיתליאליות של Caco-2 הבריאות שגודלו בלוח תרבית מצופה קולגן עם 24 בארות מהאינקובטור ושאבו את כל המדיה מכל באר.

פיפט מיליליטר אחד של סרום ומדיה ללא אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה לכל באר. שאפתי את המדיה כדי להסיר שאריות מהמדיה וחזרו על השטיפה פעם נוספת, לסך הכל שתי שטיפות בסך הכל. כעת הוסיפו 1 מיליליטר של מדיום זיהום שהוכן מראש המכיל את AIEC לכל באר של לוח 24 בארות המכיל את תאי Caco-2.

צנטריפוגה את לוח 24 הבארים ב-500 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לסנכרן מגע חיידקי עם שכבת האפיתל ולדגור את הלוח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שלוש שעות כדי לאפשר פלישה חיידקית. הכינו מדיום המכיל אנטיביוטיקה על ידי הוספת 240 מיקרוגרם למיליליטר של אמיקאצין לסרום שחומם מראש ולמדיה נטולת אנטיביוטיקה-אנטי-אנטיקוטיקה. לאחר תקופת ההדבקה, שאיפת המדיה מהשכבה המונולרית של תאי Caco-2 ושטפו כל באר ב-1 מיליליטר של סרום ומדיה נטולת אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית.

שאפו את המדיה וחזרו על השטיפה פעם נוספת, לסך הכל שתי שטיפות בלבד. לאחר מכן, פיפטה של מיליליטר אחד של 240 מיקרוגרם למיליליטר, מדיום המכיל אמיקאצין לכל באר. במקביל, טיפלו בסט נוסף של תאים ב-100 מיקרוגרם למיליליטר גנטמצין להשוואה ודגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שעה אחת כדי להיפטר מחיידקים חוץ-תאיים.

לאחר הדגירה, שאפו את המדיה מכל באר. הוסף 1 מיליליטר של PBS כדי לשטוף את החיידקים הדביקים. שואף את ה-PBS וחזר על השטיפה פעם נוספת, לסך הכל שתי שטיפות נוספות.

כעת הוסיפו 200 מיקרוליטר של 1% Triton X100 מדולל ב-PBS לכל באר ודגרו על שייקר אורביטלי במהירות של 90 סיבובים לדקה במשך 10 דקות כדי לפרק תאי אפיתל. פיפטה למעלה ולמטה בערך 30 פעמים בכל באר כדי לנתק את התאים מהלוח. לאחר מכן, לבצע דילול סדרתי של הליזטים של התאים בלוח של 96 בארות באמצעות PBS.

לוח 10 מיקרוליטר של דילול נקודתי בשלושה עותקים מהלא מדולל ל-10 בעוצמה של 3 דילול על לוחות הקידוח LB. לאחר שהכתמים יבשו, דגרו את הלוחות במשך הלילה בטמפרטורה של 27 עד 30 מעלות צלזיוס כדי לקבל מושבות בודדות נקיות. לאחר הדגירה, הסר את הלוחות וספירת מושבות מבודדות היטב מהדילול המתאים של הנקודות המכילות יותר משבע מושבות בכל נקודה לאורך שלוש העותקים.

לבסוף, מחשב את האנוקלום ואספו יחידות יוצרות מושבות לכל מיליליטר ואחוז פלישה באמצעות המשוואות. טיפול בגנטמיצין או אמיקאסין לאחר זיהום בשכבת מונו-שכבת תאי Caco-2 בזן הפולשני AIEC NRG857c, או בזן האלפא הבקרה הלא פולשני Escherichia coli DH5 הוביל לפרופילי פלישה דומים. ממצאים אלו הצביעו על כך שאמיקוסין יעיל כמו גנטמצין בהסרת חיידקים חוץ-תאיים ומשקף במדויק את נטל החיידקים התוך-תאי.

הטיפול בבידוד קליני עמיד לגנטמיצין של אשריכיה קולי שהתקבל מחולים עם מחלת מעי דלקתית עם גנטמצין הביא לערכי התאוששות חיידקיים משתנים מאוד שנעו בין כ-21 ל-2,788%. לעומת זאת, טיפול באמיקאצין הפחית באופן דרמטי את ההתאוששות החיידקיים בכל הבודדים, מה שהוכיח את יעילותו ואפשר מדידות פלישה אמינות יותר. פרוטוקול זה מאפשר כימות מדויק של חיידקים תוך-תאיים והערכת פלישת חיידקים לתאי אפיתל. שיטות נוספות כמו מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנצנטית יכולות לשמש לאימות פלישת חיידקים ולאימות מיקום תוך-תאי.

מחקרים עתידיים יוכלו לזהות גורמי אלימות חדשים ולחקור מסלולי מארח המכוונים במהלך זיהום E.coli פולשני דבק.