Name: שחזור הרכבת אקטין מסועבת המתווכת על ידי Myosin-I במערך בדיקה לתנועת זנב-שביט של אקטין מבוסס חרוזיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: למדו שחזור אינטראקציה בין myosin-I, אקטין ומורכב Arp2/3 בממשק דמוי ממברנה. הפרוטוקול מאפשר ניתוח כמותי של הרכבת רשת אקטין ויצירת כוח בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לד"ר Daniel Safer ול-Rick Wike על סיוע טכני מעולה בטיהור חלבונים. אנו מודים לד"ר Roberto Dominguez, ובמיוחד לד"ר Malgorzata Boczkowska ולד"ר Grzegorz Rebowski, על אספקתם הנדיבה של קומפלקס Arp2/3 וחלבונים CapZ. אנו מודים גם לד"ר Luther Pollard, לד"ר Faviolla A. Báez-Cruz, ולכל חברי המעבדות של Ostap ו-Dominguez על תרומתם בעלת הערך לאורך הפרויקט. עבודה זו נתמכה על ידי מענק R37 GM057247 של המכוניים הלאומיים לבריאות (NIH) (עבור E.M.O.). E.M.O. ו-M.X. זכו לתמיכה חלקית מהקרן הלאומית למדע (CMMI-1548571). ChatGPT שימש לסיוע בעריכת השפה במהלך סקירת כתב היד. המחברים סקרו ועריכו את כל התכנים שנוצרו בסיוע בינה מלאכותית והם נושאים באחריות מלאה לכתב היד הסופי.

<ol>
	<li>Blanchoin L, Boujemaa-Paterski R, Sykes C, Plastino J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 2014;94(1):235-63.</li>
	<li>Svitkina T. The actin cytoskeleton and actin-based motility. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018;10(1).</li>
	<li>Papalazarou V, Machesky LM. The cell pushes back: The Arp2/3 complex is a key orchestrator of cellular responses to environmental forces. Curr Opin Cell Biol. 2021;68:37-44.</li>
	<li>Krendel M, Gauthier NC. Building the phagocytic cup on an actin scaffold. Curr Opin Cell Biol. 2022;77:102112.</li>
	<li>Yang C, et al. Actin polymerization promotes invagination of flat clathrin-coated lattices in mammalian cells by pushing at lattice edges. Nat Commun. 2022;13(1):6127.</li>
	<li>Clarke DN, Martin AC. Actin-based force generation and cell adhesion in tissue morphogenesis. Curr Biol. 2021;31(10):R667-R80.</li>
	<li>McConnell RE, Tyska MJ. Leveraging the membrane-cytoskeleton interface with myosin-1. Trends Cell Biol. 2010;20(7):418-26.</li>
	<li>Almeida CG, et al. Myosin 1b promotes the formation of post-Golgi carriers by regulating actin assembly and membrane remodelling at the trans-Golgi network. Nat Cell Biol. 2011;13(7):779-89.</li>
	<li>McIntosh BB, Ostap EM. Myosin-I molecular motors at a glance. J Cell Sci. 2016;129(14):2689-95.</li>
	<li>Pedersen RTA, Drubin DG. Type I myosins anchor actin assembly to the plasma membrane during clathrin-mediated endocytosis. J Cell Biol. 2019;218(4):1138-47.</li>
	<li>Barger SR, et al. Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis. Nat Commun. 2019;10(1):1249.</li>
	<li>Manenschijn HE, et al. Type-I myosins promote actin polymerization to drive membrane bending in endocytosis. eLife. 2019;8.</li>
	<li>Smith SL, et al. Class-I myosin responds to changes in membrane tension during clathrin-mediated endocytosis in human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2026;123(9):e2532817123.</li>
	<li>Loisel TP, Boujemaa R, Pantaloni D, Carlier MF. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. Nature. 1999;401(6753):613-6.</li>
	<li>Akin O, Mullins RD. Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex. Cell. 2008;133(5):841-51.</li>
	<li>Boujemaa-Paterski R, et al. Directed actin assembly and motility. Methods Enzymol. 2014;540:283-300.</li>
	<li>Sykes C, Plastino J. Reconstitution of actin-based motility with commercially available proteins. J Vis Exp. 2022;(188).</li>
	<li>Xu M, et al. Myosin-I synergizes with Arp2/3 complex to enhance the pushing forces of branched actin networks. Sci Adv. 2024;10(37):eado5788.</li>
	<li>Kawska A, et al. How actin network dynamics control the onset of actin-based motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(36):14440-5.</li>
	<li>Cameron LA, Footer MJ, van Oudenaarden A, Theriot JA. Motility of ActA protein-coated microspheres driven by actin polymerization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(9):4908-13.</li>
	<li>Bernheim-Groswasser A, et al. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 2002;417(6886):308-11.</li>
	<li>van der Gucht J, Paluch E, Plastino J, Sykes C. Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(22):7847-52.</li>
	<li>Achard V, et al. A &#34;primer&#34;-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility. Curr Biol. 2010;20(5):423-8.</li>
	<li>Noireaux V, et al. Growing an actin gel on spherical surfaces. Biophys J. 2000;78(3):1643-54.</li>
	<li>Theriot JA, Mitchison TJ, Tilney LG, Portnoy DA. The rate of actin-based motility of intracellular Listeria monocytogenes equals the rate of actin polymerization. Nature. 1992;357(6375):257-60.</li>
	<li>Bieling P, et al. WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation. EMBO J. 2018;37(1):102-21.</li>
	<li>Funk J, et al. A barbed end interference mechanism reveals how capping protein promotes nucleation in branched actin networks. Nat Commun. 2021;12(1):5329.</li>
	<li>Gautreau AM, Fregoso FE, Simanov G, Dominguez R. Nucleation, stabilization, and disassembly of branched actin networks. Trends Cell Biol. 2022;32(5):421-32.</li>
	<li>Nakamura F, Osborn E, Janmey PA, Stossel TP. Comparison of filamin A-induced cross-linking and Arp2/3 complex-mediated branching on the mechanics of actin filaments. J Biol Chem. 2002;277(11):9148-54.</li>
	<li>Colin A, et al. Friction patterns guide actin network contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(39):e2300416120.</li>
	<li>Colin A, et al. Recycling of the actin monomer pool limits the lifetime of network turnover. EMBO J. 2023;42(9):e112717.</li>
	<li>Suarez C, et al. Reconstitution of the transition from a lamellipodia- to filopodia-like actin network with purified proteins. Eur J Cell Biol. 2023;102(4):151367.</li>
	<li>Pollard LW, Boczkowska M, Dominguez R, Ostap EM. Myosin-1C differentially displaces tropomyosin isoforms altering their inhibition of motility. J Biol Chem. 2024;300(8):107539.</li>
	<li>Thompson CP, et al. Non-muscle tropomyosins inhibit myosin-19 and dynamically localize to mitochondrially associated actin filaments. J Biol Chem. 2026;302(5):111377.</li>
	<li>Bussonnier M, et al. Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex. Biophys J. 2014;107(4):854-62.</li>
	<li>Paluch E, van der Gucht J, Joanny JF, Sykes C. Deformations in actin comets from rocketing beads. Biophys J. 2006;91(8):3113-22.</li>
	<li>Lewis JH, Lin T, Hokanson DE, Ostap EM. Temperature dependence of nucleotide association and kinetic characterization of Myo1b. Biochemistry. 2006;45(38):11589-97.</li>
	<li>Baez-Cruz FA, Ostap EM. Drosophila class-I myosins that can impact left-right asymmetry have distinct ATPase kinetics. J Biol Chem. 2023;299(8):104961.</li>
	<li>Lin T, Tang N, Ostap EM. Biochemical and motile properties of Myo1b splice isoforms. J Biol Chem. 2005;280(50):41562-7.</li>
	<li>Lebreton G, et al. Molecular to organismal chirality is induced by the conserved myosin 1D. Science. 2018;362(6417):949-52.</li>
	<li>Spudich JA, Watt S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J Biol Chem. 1971;246(15):4866-71.</li>
	<li>Boczkowska M, et al. X-ray scattering study of activated Arp2/3 complex with bound actin-WCA. Structure. 2008;16(5):695-704.</li>
	<li>Rao JN, Madasu Y, Dominguez R. Mechanism of actin filament pointed-end capping by tropomodulin. Science. 2014;345(6195):463-7.</li>
	<li>Putkey JA, Slaughter GR, Means AR. Bacterial expression and characterization of proteins derived from the chicken calmodulin cDNA and a calmodulin processed gene. J Biol Chem. 1985;260(8):4704-12.</li>
	<li>Schindelin J, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9(7):676-82.</li>
	<li>Greenberg MJ, Ostap EM. Regulation and control of myosin-I by the motor and light chain-binding domains. Trends Cell Biol. 2013;23(2):81-9.</li>
	<li>Lewis JH, et al. Calcium regulation of myosin-I tension sensing. Biophys J. 2012;102(12):2799-807.</li>
	<li>Manceva S, et al. Calcium regulation of calmodulin binding to and dissociation from the Myo1c regulatory domain. Biochemistry. 2007;46(42):11718-26.</li>
	<li>Mullins RD, Bieling P, Fletcher DA. From solution to surface to filament: actin flux into branched networks. Biophys Rev. 2018;10(6):1537-51.</li>
	<li>Mooren OL, et al. Reconstitution of Arp2/3-nucleated actin assembly with proteins CP, V-1, and CARMIL. Curr Biol. 2024;34(22):5173-86.e4.</li>
	<li>Pollard LW, et al. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Mol Biol Cell. 2020;31(5):335-47.</li>
	<li>Marcy Y, Prost J, Carlier MF, Sykes C. Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(16):5992-7.</li>
	<li>Dayel MJ, et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biol. 2009;7(9):e1000201.</li>
	<li>Hammer JA 3rd, Sellers JR. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;13(1):13-26.</li>
	<li>Buss F, Kendrick-Jones J. How are the cellular functions of myosin VI regulated within the cell. Biochem Biophys Res Commun. 2008;369(1):165-75.</li>
	<li>Spudich JA, Sivaramakrishnan S. Myosin VI: an innovative motor that challenged the swinging lever arm hypothesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(2):128-37.</li>
	<li>Self T, et al. Shaker-1 mutations reveal roles for myosin VIIA in both development and function of cochlear hair cells. Development. 1998;125(4):557-66.</li>
	<li>Crawley SW, et al. Intestinal brush border assembly driven by protocadherin-based intermicrovillar adhesion. Cell. 2014;157(2):433-46.</li>
	<li>Houdusse A, Titus MA. The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia. Curr Biol. 2021;31(10):R586-R602.</li>
	<li>Bohil AB, Robertson BW, Cheney RE. Myosin-X is a molecular motor that functions in filopodia formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(33):12411-6.</li>
	<li>Fitz GN, et al. Protrusion growth driven by myosin-generated force. Dev Cell. 2023;58(1):18-33.</li>
	<li>Quintero OA, et al. Human Myo19 is a novel myosin that associates with mitochondria. Curr Biol. 2009;19(23):2008-13.</li>
	<li>Zimmet A, et al. Cryo-EM structure of NPF-bound human Arp2/3 complex and activation mechanism. Sci Adv. 2020;6(23):eaaz7651.</li>
	<li>Giardini PA, Fletcher DA, Theriot JA. Compression forces generated by actin comet tails on lipid vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(11):6493-8.</li>
	<li>Upadhyaya A, Chabot JR, Andreeva A, Samadani A, van Oudenaarden A. Probing polymerization forces by using actin-propelled lipid vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(8):4521-6.</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים פיננסיים או קונפליקטים של אינטרסים.

בדיקת ניידות חרוזי זנב-שביט של אקטין היא מערכת רקונסטרוקציה in vitro מבוססת לחקר הרכבת אקטין מסועפת המתווכת על ידי קומפלקס Arp2/3 ותפקידה ביצירת כוחות דחיפה14,15,16,17. מערכת זו יושמה באופן נרחב כדי לנתח את הרגולציה הביוכימית של הרכבת אקטין מסועפת14,15,26,27,31,49,50,51 ויצירת כוח20,21,22,23,52, תוך שהיא מספקת מסגרת למחקרים כמותיים של תכונות חומר פעיל (active matter) הנובעות מרשתות אקטין19,35,36,53. על ידי שילוב מיוזין, ובמיוחד myosin-I18, במערכת רקונסטרוקציה זו, הבדיקה המודפית מאפשרת לחקור כיצד צימוד בין מיוזין לאקטין מודולטר את הרכבת האקטין ויצירת הכוח בממשק הממברנה, תחום שנותר בלתי נחקר יחסית. ראוי לציין כי ניתן להחליף בקלות את myosin-I במערכת זו במנועי מיוזין אחרים כדי לבחון את תפקידיהם בהסדרה מחדש של רשת האקטין וביצירת כוח. לדוגמה, ניתן לשלב myosin V (הסעת מטען)54, myosin VI (תעבורה אנדוציטית ודינמיקת ממברנה)55,56, myosin VII ו-XV (ארגון סטריוציליות ומיקרווילאיי)57,58,59, myosin X (היווצרות פילופודיה)60,61, ו-myosin XIX (דינמיקה מיטוכונדריאלית)62 כדי לחקור כיצד סוגים שונים של מיוזין תורמים לארגון האקטין ולתהליכים הפיזיולוגיים הנלווים אליהם.
הבדיקה ניתנת לשחזור גבוה בתנאי שמספר פרמטרים קריטיים נשלטים בקפידה. ראשית, G-actin מונומרי באיכות גבוהה חיוני ליצירת זנב-שביט (comet-tail) חסון. אנו ממליצים לנקות G-actin מאבקת אצטון של שריר שלד של ארנב תוך שימוש בפרוטוקולים מבוססים41. לאחר 2–3 ימים של דיאליזה, יש לנקות את האקטין המונומריה further באמצעות סינון ג'ל על Sephacryl S-300 ב-G-buffer (2 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.2 mM ATP; 0.1 mM CaCl2; 1 mM NaN3; ו-0.5 mM DTT). יש להשתמש בפרקציות שנאספו מיד לאחר שיא האלוציה. G-actin מנוקה שומר בדרך כלל על פעילות פולימריזציה חזקה למשך 2–3 שבועות כאשר הוא מאוחסן על קרח ב-4°C, ועשוי להישאר שמיש עד השבוע הרביעי, אם כי הביצועים בדרך כלל יורדים לאחר מכן. חסון מופחת של זנב-השביט, המאופיין ברשתות אקטין דלילות ושבירות ובצמיחה לא עקבית של הזנב, מעיד לעיתים קרובות על איכות אקטין פגועה. שנית, פעילות NPF קובעת באופן קריטי את היווצרות זנב-השביט. דומיין WCA מסומן ב-GST ממקור מסחרי מprotein של תסמונת Wiskott–Aldrich נוירונלי אנושי (N-WASP) (GST-VCA) מספק פעילות גרעין (nucleation) חסונה ומתמשכת, ודימרזציה של GST משפרת עוד יותר פעילות זו63. אנו ממליצים לתקף כל מבנה (construct) של NPF באמצעות בדיקת פולימריזציה של pyrene-actin לפני ציפוי החרוזים. הפעילות של GST-VCA המסחרי יכולה לשמש כסטנדרט ייחוס. ראוי לציין כי ה-GST-VCA המסחרי שנעשה בו שימוש כאן חסר אזור פוליפרולין ולכן אינו מקיים אינטראקציה עם קומפלקסים של profilin–actin26. שלישית, ויזואליזציה אמינה של צמיחת זנב-השביט דורשת הכנה קפדנית של השקפים והכיסויים. אנו ממליצים לנקות ביסודיות שקפים וכיסויים עם מים ואתנול, ולאחריהם ניקוי בפלזמה מיד לפני השימוש. כאשר הם זמינים, כיסויים מסוג polyethylene glycol–silanized26 מועדפים מכיוון שהם ממזערים ספיחה לא ספציפית של חלבונים ומשפרים את השחזוריות. הוספה של ריכוז הולם של BSA לתערובת הניידות יכולה להפחית עוד יותר אינטראקציות לא ספציפיות עם פני השטח ולקדם ביצועי בדיקה עקביים. רביעית, נפח הדגימה המוחל על התא קריטי למדידות אמינות15,16,17. נפח דגימה מופרז גורם לסחיפה של חרוזים, מה שמונע מעקב מדויק אחר התארכות זנב-השביט. לעומת זאת, נפח דגימה לא מספיק דוחס את החרוזים בין השקף לכיסוי, מה שמגביר את החיכוך ומקבע את החרוזים. אילוץ מכני זה עלול לעוות את מורפולוגיית זנב-השביט ולשנות את קינטיקת הצמיחה הנמדדת. לכן, אופטימיזציה של גובה התא ונפח הדגימה חיונית לתוצאות שחזירות. אנו ממליצים לבצע אופטימיזציה אמפירית של נפח הדגימה עבור כל מערך ניסויי. בעת שימוש בכיסוי בגודל 22 mm × 22 mm כפי שמתואר כאן, הפעלת 2.1–2.3 µL של תערובת הניידות יוצרת גובה תא של כ-4.3 µm, מה שמאפשר מיקום יציב של חרוזים בקוטר 2.0-µm ללא סחיפה או דחיסה מופרזת.&#160;כאשר נעשה שימוש בכיסוי בגודל שונה, יש להתאים את נפח הדגימה בהתאם כדי להשיג מילוי אחיד של התא, מיקום יציב של החרוזים וסחיפה מינימלית של הדגימה.
אם זנבות השביטים אינם נוצרים, יש לוודא את היכולת לפולימריזציית אקטין ואת הפעילות של NPF. אם לא חלה שבירת סימטריה, יש להתאים את ריכוז ה-CP כדי לווסת את צפיפות הרשת. רשתות צפופות מדי עומדות בפני שברים, בעוד שרשתות דלילות מדי חסרות שלמות מבנית. אם חרוזיים מצופים במיאוזין אינם מראים הבדל לעומת חרוזי ביקורת, יש לאשר את צפיפות המיאוזין על פני השטח ואת פעילות המנוע. לצורך בקרת איכות, קריטריון הקבלה הוא פונקציונלי ולא מבוסס על סף מספרי מוחלט. הכנה חדשה תיחשב לקבילה אם,&#160;הוא משחזר את היווצרות וצמיחת זנב השביט שנצפו בהכנה שאושרה בעבר (כפי שמוצג ב-&#160;איור 3). בנוסף, יש להעריך כל הכנה חדשה של מיוזין, קומפלקס Arp2/3, NPF, CapZ או אקטין באמצעות בדיקות בקרת איכות מתאימות ולהשוותה להכנה שאושרה בעבר לפני השימוש, וזאת כדי להבטיח עקביות בין ניסויים כמותיים (ראה סעיף 3.1 של הפרוטוקול).
יש לשקול מספר מגבלות של בדיקה זו בעת פירוש התוצאות. ראשית, עוצמת הפלואורסצנציה משמשת כמדד יחסי ולא מכויל לצפיפות רשת האקטין; לפיכך, השוואות צריכות להתבצע רק בין דגימות שצולמו תחת הגדרות רכישה זהות ונותחו באמצעות אותו תהליך סף (thresholding). שנית, ניידות חרוזיים, צמיחת "זנב השביט" (comet-tail) ויעילות הצמיחה מספקות קריאות עקיפות של התנהגות רשת מייצרת כוח, אך אינן מהוות מדידות ישירות של כוח. מדידות מכניות ישירות, כגון מלכודת אופטית או בדיקות עיוות ממבנה מכוילות-כוח64,65, נחוצות כדי לכמת את הכוחות המופעלים על ידי הרשת. שלישית, בדיקה זו אינה פותרת באופן ישיר את an ultra-structure של רשת האקטין, למשל אוריינטציית סיבים, צפיפות הסתעפויות או ארגון מקומי של מיוזין.&#160;ייתכן שיידרשו גישות משלימות כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית או דימיון ברזולוציה-על (super-resolution imaging) לצורך אפיון מבני בקנה מידה ננומטרי&#160;. לבסוף, שימוש בחרוזים קשיחים בגודל מיקרוני מספק ממשק פשוט וניתן לניהול ניסיוני, אך הוא אינו לוכד את היכולת לעיוות, את ההטרוגניות של העקמומיות, את ניידות הליפידים או את המורכבות המולקולרית של ממבנים תאיים. לפיכך, פיתוח עתידי של ממשקים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית יהיה חשוב לחקר האופן שבו רכיבי השלד התאי מתואמים בקצה המוביל של התא.
באופן כללי, גישת הרכבה מחדש (reconstitution) זו מספקת שליטה מדויקת בהרכב ובריכוז החלבונים, ובכך מאפשרת לנתח מרכיבים בודדים באופן מכניסטי בדרכים שקשה להשיגן במערכות תאיות. היא מספקת פלטפורמה רב-גונית לחקר האופן שבו מנועים מולקולריים מעצבים מחדש רשתות אקטין מסועפות וקובעים את ייצור הכוח בממשקים דמויי ממבנה. עם תיקוף מתאים, ניתן להרחיב את הבדיקה כדי לבחון כיצד מחלקות שונות של מיוזין, גרסאות מוטנטיות או גרסאות של מנועים הקשורות למחלות, וחלבונים קושרי-אקטין רגישים לכוח, מווסתים משוב מכני בתוך רשתות אקטין דינמיות. באופן רחב יותר, מערכת זו מסייעת לקשר בין פעילות מנועים בקנה מידה מולקולרי לבין ארגון השלד התאי ותפקוד מכני בקנה מידה מזוסקופי, עם השלכות על ניידות תאים, אנדוציטוזה ועיצוב מחדש של הממבנה.

פולימריזציה של אקטין מסועף המתווכת על ידי קומפלקס החלבון Arp2/3 (actin-related protein 2/3) יוצרת את כוחות הדחיפה הראשוניים המניעים תהליכים תאיים מגוונים, הכוללים ניידות תאית, אנדוציטוזה, פגוציטוזה ויצירת קומפלקסים של היצמדות תאית1,2,3,4,5,6. בקצה המוביל של תאים נודדים, גורמים מקדמי גרעין (nucleation-promoting factors; NPFs) מפעילים את קומפלקס Arp2/3 בממברנת הפלזמה, ובכך יוזמים הרכבה של רשת אקטין דנדריטית הדוחפת את הממברנה קדימה. מנועי Myosin-I נמצאים לעיתים קרובות במיקום משותף עם רשתות אקטין מסועפות אלו בממשקי ממברנה, והם מעורבים בוויסות של &#160;ארגון האקטין&#160;ובבקרת ייצור כוח7,8,9,10,11,12,13. למרות עדויות מצטברות לכך ש-myosin-I תורם לתהליכים מכניים תלויי-אקטין, המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם myosin-I מקייים אינטראקציה עם הרכבת אקטין מסועף המתווכת על ידי Arp2/3 כדי לווסת את ארכיטקטורת הרשת ואת התוצר המכני, נותרו לא understood היטב.
כדי לגשר על פער זה, שילבנו myosin-I במערכת המוכרת של תנועת חרוזי זנב-שביט מאקטין (actin comet-tail bead motility system)14,15,16,17, כדי לשחזר את הגומלין בין myosin-I, own actin וקומפלקס Arp2/3 על פני שטח של חרוזים בגודל מיקרוני. המטרה הכללית של שיטה זו היא לחקור באופן כמותי כיצד הצימוד בין myosin למאקטין משפיע על הרכבת מאקטין מסועף, ארכיטקטורת הרשת, שבירת סימטריה ותנועת חרוזים בממשק דמוי-ממברנה. בתבחנה זו, myosin-I ו-NPFs מצופים במקביל על חרוזים בקנה מידה מיקרוני כדי לחקות את הלוקליזציה המשותפת שלהם בממברנת הפלסמה18. עם תחילת הפולימריזציה, NPFs הקשורים לפני השטח מעבבים הרכבת מאקטין מסועף התלויה ב-Arp2/3, מה שמוביל להיווצרות מעטפת מאקטין, שבירת סימטריה ופיתוח של זנב-שביט מקוטב&#160;המניע את החרוז קדימה14,19,20,21,22,23. על ידי שינוי שיטתי של צפיפות ה-myosin על פני השטח18 וויסות צפיפות רשת המאקטין באמצעות ריכוז חלבון סגירה (CP)15,19,24, שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של קינטיקת הרכבת המאקטין, יעילות הצמיחה, ארכיטקטורת הרשת ותנועת החרוזים, ובכך מספקת מדדים עקיפים הקשורים לשינויים בתפוקה המכנית התלויים ב-myosin-I.
הבדיקה מציעה גם יתרונות מובהקים על פני גישות משלימות. בהשוואה לבדיקות פולימריזציה בכמות גדולה (bulk polymerization), כגון בדיקות פירן-אקטין (pyrene-actin), מערכת תנועת החריסים זו מאפשרת ויזואליזציה ישירה של הרכבת אקטין מסועף ותנועת חריסים המונעת מפולימריזציית אקטין. בניגוד למחקרים תאיים, שבהם תפקודי חלבון חופפים וסביבות תאיות מורכבות עלולים להסתיר תרומות 개별יות ולסבך את הפרשנות, בדיקה זו מספקת שליטה מדויקת על הרכב החלבונים, הריכוז וארגון הפני השטח, ובכך מאפשרת חקירה שיטתית של האופן שבו myosin-I מקייים אינטראקציה עם הרכבת אקטין המתווכת על ידי Arp2/3 תחת תנאים ביוכימיים מוגדרים.
שיטה זו היא המתאימה ביותר לחקר האופן שבו רכיבי השלד התאי מתואמים בממשק דמוי-ממברנה&#160;כדי לווסת את ארכיטקטורת רשת האקטין ואת התוצר המכני. למרות שהפרוטוקול הנוכחי מותאם להרכבת אקטין מסועף המתווכת על ידי myosin-I, ניתן להתאים את התכנון המודולרי שלו בעתיד כדי לבחון מחלקות אחרות של מיוזין הקשורות לממברנה (למשל, myosin VI, VII, X, XV, ו-XIX) ו/או חלבוני קישור לאקטין (למשל, formins, vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP), cortactin, coronin, או tropomyosin). התאמות כאלה ידרשו תיקוף של קיבוע החלבון, פעילותו וצפיפותו על פני השטח. בנוסף, הבדיקה מתאימה לאסטרטגיות סימון מסוג pulse-chase. שילוב של אקטין photoconvertible או photoactivatable, או תתי-יחידות מסומנות של Arp2/3, עשוי לאפשר מדידה של קצב תחלופת סיבים וקצבי התנתקות של הסתעפויות בתוך הרשת הגדלה25. באופן כללי, בדיקה זו מספקת פלטפורמה רב-גונית לבחינת האינטראקציה המולקולרית בין מנועים הקשורים לממברנה, סיבי אקטין וחלבוני קישור לאקטין, כמו גם לבדיקה כיצד מנועים וחלבוני קישור לאקטין מווסתים את עיצוב הרשת מחדש ואת יצירת הכוח בממשקים דמויי-ממברנה14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34. במובן רחב יותר, היא משמשת גם כפלטפורמת חומר פעיל (active matter) מינימלית וניתנת לכיוונון לחקירת העקרונות הפיזיקליים העומדים בבסיס דינמיקה של מצב שאינו שיווי משקל המונעת על ידי מנועים, כגון שבירת סימטריה, ארגון עצמי, משוב מכנו-כימי והתנהגויות מתהוות אחרות ברשתות אקטומיוזין פעילות18,19,20,21,22,23,35,36, עם רלוונטיות פוטנציאלית לפיזיקה של חומר פעיל ולהנדסת חומרים.

<table><tbody><tr><td>אדנוזין 5&amp;prime;מלח נתרן דו-פוספט טריפוספט הידרט</td><td>סיגמא</td><td>A26209</td><td>משמש להכנת בופרים המכילים ATP; יש לחלק למנובות (aliquots) ולאחסן ב- &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>קומפלקס Arp2/3</td><td>הוכן במעבדה</td><td>מכיוון שלא סופק טקסט מקור לתרגום, אנא ספק את התוכן באנגלית שברצונך לתרגם לעברית עבור JoVE.</td><td>משמש להגרמה של רשתות אקטין מסועפות; טוהרה בהתאם למקור 42.</td></tr><tr><td>צבע פלואורסצנטי Biotin-CF640</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>משמש לסומן פלואורסצנטי של חרוזי בקרה; יש להגן מאור ולאחסן ב- &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Myo1d ביוטיניליד</td><td>הוכן במעבדה</td><td>לא רלוונטי</td><td>חלבון מוטור המשמש לקישוט חרוזיים מצופים במיאוזין; הוכן כפי שמתואר במקורות 18 ו-38&amp;ndash;40.</td></tr><tr><td>אלבומין משרת בקר</td><td>סיגמא</td><td>A7906</td><td>משמש עבור תמיסות חסימה של חרו지를 ותמיסות אחסון של חרו지를; הכין תמיסת מלאי מסוננת.</td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>C7902</td><td>רכיב בופר המשמש בבופר X ובניסויי שיבוש סידן.</td></tr><tr><td>קלמודולין</td><td>הוכן במעבדה</td><td>לא רלוונטי</td><td>נוסף לתגובות המכילות מיוזין (myosin) ולבuffer אחסון חרוזיים; טוהה בהתאם לסימוכין 44.</td></tr><tr><td>חרוזי פוליסטירן קרבוקסילאטיים (2.0 &amp;micro;m קוטר)</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>משמש כתמיכה מוצקה עבור NPF, NeutrAvidin, צבע פלואורסצנטי וציפוי מיוזין; יש להניח ב- 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>משמש לרכישת תמונות פלואורסצנציה במהלך מיקרוסקופיה של צילומי Time-lapse.</td></tr><tr><td>צביעת Coomassie Brilliant Blue</td><td>סיגמא</td><td>B7920</td><td>משמש לצביעת ג'לים של SDS-PAGE לפני ניתוח דנסیتומטרי.</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי, 22 מ"מ &amp;times; 22 מ"מ, #1.5</td><td>גלובוס</td><td>1404-15</td><td>משמש עם זכוכית נשואת מיקרוסקופ להרכבת תאי דחיסה.</td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>חומר מחזר המשמש בתמיסות בופר ובתערובות ניידות; יש לאחסן ב- &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>משאבת ואקום סלילית יבשה</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>משמש להפעלת מערכת הניקוי בפלסמה.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>קלטור סידן המשמש בבופר M, בבופר ניידות ובטיפול מקדים של אקטין.</td></tr><tr><td>מקור אור חיצוני</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>מקור אור מהלואיד-מתכת עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>קוד פתוח</td><td>לא רלוונטי</td><td>השתמש בתוכנה לניתוח אורך זנב השביט, עוצמת פלואורסצנציה וצפיפות רשת (גרסה 2.16.0/1.54p).</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנציה</td><td>Leica</td><td>DMIRB</td><td>מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה הפוך המשמש להדמיה של זנבות שביות של אקטין.</td></tr><tr><td>חומצה אצטית גלציאלית</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>מרכיב של תמיסת הסרת הצבע (destaining) עבור ג'ל SDS-PAGE; חומר מאכל, יש לטפל בזהירות ובבטיחות.</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>שלד התא</td><td>VCG03-A</td><td>גורם מקדם גרעין המשמש להרכבת אקטין המתווכת על ידי Arp2/3; יש לחלק למנות ולאחסן ב- &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>סוכן חיצוי (Buffering reagent) המשמש בבופר X, בבופר M ובבופר תנועתיות (motility buffer).</td></tr><tr><td>CapZ אנושי</td><td>הוכן במעבדה</td><td>לא רלוונטי</td><td>חלבון סגירה (Capping protein) המשמש לוויסות צפיפות רשת האקטין; טוהה בהתאם למקור 43.</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>רכיב בופר המשמש בבופרי תגובה ובטיפול מקדמי של אקטין.</td></tr><tr><td>תוכנת הדימוג MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>לא רלוונטי</td><td>משמש לבקרת המיקרוסקופ ולרכישת תמונות (גרסה 7.10.4.459).</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא</td><td>MX0485-3</td><td>מרכיב של תמיסת הסרת הצבע עבור ג'ל SDS-PAGE; דליק, יש לטפל בהתאם לנהלי הבטיחות המוסדיים.</td></tr><tr><td>מתילצלולוז</td><td>סיגמא</td><td>M0387</td><td>נוסף לתמיסת הניידות (motility buffer) כדי להעלות את צמיגות התמיסה (1500 cP).</td></tr><tr><td>זכוכית למקרוסקופ (סליידים)</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>משמש להרכבת תאי לחיצה (squeeze chambers) עבור מיקרוסקופיה.</td></tr><tr><td>חלבון NeutrAvidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>משמש לקיבוע של חלבונים ביוטיניליים על פני שפשפונים (beads); יש לחלק למכסויות (aliquots) ולאחסן ב- &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>סולם חלבונים צבוע מראש PageRuler Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>סמן משקל מולקולרי המשמש לאנליזת SDS-PAGE; יש לשמור בטמפרטורה של &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>מנקה פלסמה</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>משמש לניקוי בפלסמה של שקופיות מיקרוסקופ וכיסויות לפני הרכבת התא.</td></tr><tr><td>מסנן מזרקה מפוליאתרסולפון, 0.22 &amp;micro;m</td><td>סיגמא</td><td>SLGPR33RS</td><td>משמש לסינון של תמיסת המלאי של אלבומין משרת בקר (bovine serum albumin) לפני חלוקה לאליקוטים.</td></tr><tr><td>אשלגן כלוריד</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>מלח המשמש לשמירה על חוזק יוני בבפרי בבפרוטוקול הבדיקה (assay buffers).</td></tr><tr><td>אקטין משריר שלד של ארנב</td><td>הוכן במעבדה</td><td>במידה ואין טקסט מקור לספק, אנא הזן את התוכן המיועד לתרגום.</td><td>טוהר בהתאם לסימוכין 41 ושימש כ-G-actin עבור בדיקות הרכבת זנב שביט של אקטין.</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>משמש למשקיעה (pelleting) של חרוזיים במהלך שלבי הכנת החרוזים ושטיפתם.</td></tr><tr><td>מערבל מבחנות סיבובי (רוטטור שולחני)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>משמש במהלך דגירות לציפוי חרוצים כדי לשמור על סספנסיות החרוצים.</td></tr><tr><td>תמיסת ריצה (running buffer) של Tris/Glycine/SDS (10&amp;times;)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>דלל עד ל-1&amp;times; לפני אלקטרופורזה ב-SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>גריס ואקום</td><td>High Vac Depot</td><td>408524</td><td>משמש לאיטום תאי לחיצה לפני דימות פלואורסצנציה.</td></tr><tr><td>4%&amp;ndash;ג'ל פוליאקרילאמיד-SDS במדרג של 20%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>משמש לאנליזת SDS-PAGE של חלבונים הקשורים לחרוצים; יש לשמור ב- 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

שחזור הרכבת אקטין מסועבת המתווכת על ידי myosin-i במערך בדיקה לתנועת זנב-שביט של אקטין מבוסס חרוזיים

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

פולימריזציה של אקטין מסועף המתווכת על ידי קומפלקס החלבון הקשור לאקטין 2/3 (Arp2/3) מספקת את כוחות הדחיפה העיקריים למגוון תהליכים תאיים, כולל נדידת תאים, אנדוציטוזה ופגוציטוזה. מנועי Myosin-I, אשר ממוקמים לעיתים קרובות יחד עם רשתות אקטין מסועפות בקצה המוביל של התא, הוכחו אף הם כמשתתפים בתהליכים אלו ונחשבים כמי שמסדירים את ארגון רשת האקטין ואת התפוקה המכנית. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שדרכם Myosin-I מקשר עם קומפלקס Arp2/3 כדי לווסת את הרכבת האקטין המסועף ויצירת כוחות נותרו במידה רבה לא ידועים. כאן, אנו מתארים בדיקת ניידות של חרוזי "זנב-שביט" (comet-tail) של אקטין in vitro בעלת יכולת כיוונון גבוהה, המשחזרת את הגומלין בין Myosin-I, אקטין וקומפלקס Arp2/3 בקצה המוביל של התא על פני שטחם של חרוזים בגודל מיקרוני. שיטה זו מותאמת מבדיקות זנב-שביט של אקטין מבוססות על ידי קיבוע משותף של Myosin-I עם גורמים מקדמי גרעין (NPFs) על פני השטח של החרוזים, ובכך יוצרים ממשק הרכבת אקטין דמוי-ממברנה. הבדיקה מאפשרת ויזואליזציה וניתוח כמותי של הרכבת רשת האקטין, צפיפות הרשת, ניידות החרוזים ויעילות הצמיחה. היא מספקת גם מדדים איכותיים עקיפים של הגברת כוח המתווכת על ידי Myosin-I ברשתות אקטין מסועפות. פרוטוקול זה כולל פונקציונליזציה של חרוזים, הרכבת התגובה, דימוי פלואורסצנציה, ניתוח תמונה כמותי ואסטרטגיות לפתרון בעיות, ובכך מספק פלטפורמה הדירה לחקר הרכבת אקטין המוסדרת על ידי Myosin-I בממשקים דמויי-ממברנה.

פרוטוקול זה מתאר בדיקת ניידות של חרוזים עם זנב שביתי של אקטין בעוצמה ניתנת לכוונון, במטרה לחקור באופן כמותי כיצד פעילות מנועי מיוזין משפיעה על הרכבת אקטין מסועף ועל ארכיטקטורת הרשת בממשק דמוי ממברנה.

שחזור הרכבת אקטין מסועבת המתווכת על ידי Myosin-I במערך בדיקה לתנועת זנב-שביט של אקטין מבוסס חרוזיים

פולימריזציה של אקטין מסועף, המתווכת על ידי קומפלקס החלבון Arp2/3 (actin-related protein 2/3), מספקת את כוחות הדחיפה העיקריים עבור מגוון של ... תהליכים תאיים

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

reconstituting-myosin-i-mediated-branched-actin-assembly-bead-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון זה, אנו מבצעים בדיקת תנועתיות חוץ גופית כדי לנתח את אינטראקציות אקטין מיוזין. תנועת הגלישה של חוטי אקטין על מולקולות מיוזין משותקות מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בדיקת תנועתיות הפוכה: טכניקה במבחנה לדמיין תנועת מיוזין על חוטי אקטין משותקים

מוצג כאן הליך לבטא ולטהר מיוסין 5a ואחריו דיון על אפיון שלה, באמצעות הרכב ומולקולה אחת במבחנה מיקרואורסצנטיות מבוססות בדיקות, וכיצד שיטות אלה ניתן לשנות עבור אפיון של מיוסין nonmuscle 2b.

התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן

מוצג כאן פרוטוקול מקיף לביצוע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים, שניתן להרחיב בקלות לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים. הפרוטוקול מפרט את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, רכישת הנתונים וניתוחם.

ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד

היווצרות של צרורות actomyosin במבחנה ומדידת ייצור כוח אנסמבל מיוזין באמצעות פינצטה אופטית מוצג ונדון.

חקר מכניקת אנסמבל מיוזין בצרורות נימה של אקטין באמצעות פינצטה אופטית

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

מאמר זה מציג פרוטוקולים להנדסה ולאפיון רשתות תלת-ממדיות מרוכבות הניתנות לכוונון של חוטי אקטין ומיקרו-טובולים המסתבכים. חומרים מרוכבים עוברים ארגון מחדש אקטיבי ותנועה בליסטית, מונעים על ידי מנועי מיוזין II וקינסין, ומכוונים על ידי הריכוזים היחסיים של אקטין, מיקרוטובולים, חלבונים מוטוריים וקרוסלינקרים פסיביים.

שחזור ואפיון מרוכבים של אקטין-מיקרוטובול עם דינמיקה ומכניקה מונעות מנוע ניתנות לכוונון

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר כוכבי שביט אקטין על פני השטח של חרוזים תוך שימוש ברכיבי חלבון זמינים מסחרית. מערכות כאלה מחקות את המבנים הבולטים הנמצאים בתאים, וניתן להשתמש בהן כדי לבחון מנגנונים פיזיולוגיים של ייצור כוח בצורה פשוטה.

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

בעבודה זו, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת לחקר הפורואלסטיות של ג'ל אקטומיוזין בתנאים מבוקרים. הדינמיקה של ג'ל האקטומיוזין והממס המוטבע מכומתים, שבאמצעותם מודגמת פורואלסטיות הרשת. אנו דנים גם באתגרים הניסיוניים, במלכודות הנפוצות וברלוונטיות למכניקת השלד התא.

המכניקה של (פורו-)רשתות אקטומיוזין אלסטיות כמערכת מודל של שלד התא

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

עצמית התאספו monolayers (Sams) נוצר זמן alkane thiols על שרשרת זהב לספק מוגדרים היטב מצעים ליצירת דפוסי חלבון תא הכליאה. הדפסה Microcontact של hexadecanethiol באמצעות חותמת (PDMS) polydimethylsiloxane ואחריו למלא את משבצות עם גליקול, הסתיים alkane תיאול מונומר מייצר דפוס שבו חלבונים בתאים לספוג רק לאזור hexadecanethiol חותמת.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

למדו שחזור אינטראקציה בין myosin-I, אקטין ומורכב Arp2/3 בממשק דמוי ממברנה. הפרוטוקול מאפשר ניתוח כמותי של הרכבת רשת אקטין ויצירת כוח בתאים.

שחזור הרכבת אקטין מסועבת המתווכת על ידי Myosin-I במערך בדיקה לתנועת זנב-שביט של אקטין מבוסס חרוזיים

גלה סרטונים נוספים