אפיון פונקציונלי של שותפים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים במערכת העצבים המרכזית של זחל הדרוזופילה באמצעות CaMPARI

המחקר שלנו מתמקד בהערכת קישוריות סינפטית פונקציונלית בין בני זוג נודים עצביים מוגדרים בזחלי דרוזופילה חיים ומנותחים. שיטות קונבנציונליות דורשות ניתוח או גירוי פיזי. פרוטוקול זה עושה שימוש באופטוגנטיקה בזחלים שלמים, ומפחית ארטיפקטים.

כדי להתחיל, יש להמיס את מדיום האגר של קמח תירס במיקרוגל למשך 8-10 שניות ללא רתיחה, ולתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר מבלי להתקשות. לפני קירור מלא, הוסיפו את כל הטרנס-רטינל, או ATR, לריכוז של 0.5 מילימולר כדי להשלים את המדיה עבור זבובים שזקוקים להפעלת csChrimson. כסה את המבחנות במלואן בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור.

נקבות בתוליות מוצלבות הנושאות את הגנים CaMPARI ו-csChrimson לבין זכרים הנושאים את גני דרייבר GAL4 ו-LexA בבקבוקי פלסטיק המכילים את המדיה המוכנה. הכינו בקבוקים מקבילים ללא ATR כבקרה. דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד שהזחלים מגיעים לשלב השלב השלישי.

השתמשו במכחול כדי לאסוף זחל בשלב שלישי. שטפו את הזחל בצלחת מיקרו-ספוט בת שלוש בארות המכילה 0.1 PBS מולרית כדי להסיר כל מזון נדבק. הנח כמות קטנה של חימר מודלינג בכל פינה של כיסוי נקי בגודל 18 על 18 מילימטר.

הניחו את הזחל בטיפה של PBS על הכיסוי ותנו לו לכוון את הצד הגחוני כלפי מטה. הניחו סלייד מיקרוסקופ נקי מעל כיסוי הכיסוי המכיל את הזחל. אבטח את החלקת הכיסוי על ידי מריחת חימר מודלינג על הפינות, תוך שימוש בלחץ מספיק כדי לייצב את הזחל מבלי לרסק אותו או לשבור את הזכוכית.

הניחו את הסלייד המכיל את הזחל על במה של מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשת אובייקטיב 40x/1.2. בממשק התוכנה של מיקרוסקופ, לחצו על Live. לאחר מכן, תחת פאנל Z Stack, לחץ על Set First ואז Set Last ואחריו Stop כדי לקבל מחסנית Z בסיסית של נוירונים פוסט-סינפטיים, שמבטאים CaMPARI.

בתפריט הערוצים, הגדר את הערוץ הירוק של 488 ננומטר עם 0.8% כוח לייזר. לאחר מכן, כוון את ערוץ האדום של 561 ננומטר ל-0.8% עוצמת לייזר. בתפריט Z Stack, הגדר את ערך המרווח ל-1 מיקרומטר.

בתפריט הרכישה, בחר Presets כדי להגדיר רזולוציית 256 x 256 פיקסלים. ערך ממוצע של קו 2, סריקה דו-כיוונית ומהירות סריקה של 9, מה שמאפשר עדכון אוטומטי של זמן הפיקסלים. לבצע את כל ההדמיה בסביבה חשוכה, תוך שמירה על פרמטרי רכישה זהים לאורך כל הניסוי.

כוון את אור הפוטקונברציה של 405 ננומטר ל-0.5% הספק לייזר. ואור גירוי אופטוגנטי של 561 ננומטר מגיע ל-0.8% הספק לייזר. לחץ על Live, ואז בחר Best Fit תחת לוח ההיסטוגרמה.

אפשר לשני הלייזרים לגרות את הזחל בו-זמנית למשך 30 שניות, ואז עצור את הגירוי. במהלך רכישת ZStack לאחר הגירוי באמצעות אותם פרמטרים כמו קו הבסיס, יש לצפות בפלואורסצנציה אדומה של CaMPARI בנוירונים מגורה בלייזר של זחלים מוזנים על ידי ATR עם פוטוקונברסציה ובקרות מינימליות. בתוכנת Fiji ImageJ, לחץ על קובץ, ואז בחר פתח.

בחלון אפשרויות הייבוא של BioFormats עם הגדרות ברירת מחדל, לחץ על OK כדי לפתוח את תמונת ZStack שנרכשה. בתפריט התמונה, בחר צבע ואז פיצול ערוצים כדי לצפות בערוצים האדומים והירוקים של התמונה שנרכשה. לחיסור ברקע, לחץ על תהליך ואז בחר חיסור רקע.

בחלון הקופץ, הגדר את רדיוס הכדור המתגלגל ל-50 פיקסלים ואז לחץ על אישור ובחר כן בחלון ערימת התהליך. לאחר מכן, בתפריט ניתוח, בחר כלים, ואז בחר ROI Manager כדי לפתוח את חלון ה-ROI. השתמש בכלי הבחירה החופשית כדי לתאר אזורים מעניינים סביב תאים בודדים.

בחלון ה-ROI, בחר הוסף כדי לשמור את המתווה שנבחר. לאחר מכן לחץ על מדידה כדי לייצר תוצאות שטח, ממוצע, סטיית תקן וצפיפות משולבת. חזרה על התהליך עבור מספר תאים של אותו זחל בערוצים ירוקים ואדומים בנפרד.

לאחר ייצוא התוצאות לגיליון אלקטרוני, מדוד את היחס אדום לירוק או יחס R ל-G של הצפיפויות המשולבות לכל תא, וממוצע את הערכים כדי לחשב את יחס R ל-G הממוצע לכל זחל עבור תמונות לפני ואחרי הגירוי הן בתמונות שלפני הגירוי והן לאחר הגירוי. לבסוף, מחשבים את השינוי בפלואורסצנציה או דלתא R ב-G על ידי הפחתת יחס הפרה-גירוי R ל-G מיחס R-ל-G לאחר הגירוי כדי לכמת את פעילות הסידן הפוסט-סינפטית. מחקרי הקישוריות הפונקציונלית בין נוירוני ארבוריזציה דנדריטית מסוג IV או cIVda לבין נוירוני אגן-4 בזחלים בשלב שלישי הראו כי הנוירונים הפנימיים של אגן-4 הראו פלואורסצנציה ירוקה בשל ביטוי CaMPARI ציטוזולי לפני הפוטקונברציה וגירוי אור אופטוגי.

לא זוהה פלואורסצנציה אדומה בתנאי בסיס, מה שמאשר את היעדר הפוטקונברציה לפני הגירוי. חשיפה סימולטנית לאור פוטוקונברסציה וגירוי אופטוגנטי הובילו להמרת אור של CaMPARI מפלואורסצנציה ירוקה לאדומה. היעדר פלואורסצנציה אדומה בשליטה מצביע על כך שהפוטוקונברסציה הונעה במיוחד על ידי פעילות נוירונית מתווכת csChrimson.

דלתא אדום על ידי פלואורסצנציה ירוקה היה גבוה משמעותית אצל בעלי חיים ניסיוניים מאשר אצל בקרות ללא ATR. פרוטוקול זה יכול לשמש לאישור שותפות סינפטית על ידי מעקב אחר גירוי פרה-סינפטי ואחריו תגובות פוסט-סינפטיות מיידיות בבעלי חיים המתפתחים חיים. השלב המאתגר ביותר הוא ששיבוט נכון של בעלי חיים ידרוש לחץ מספק כדי למנוע תנועה מבלי לפגוע בבעל החיים.

מחקרים עתידיים עשויים לאפשר מעקב, היווצרות, חיזוק ואפילו ביטול קשרים סינפטיים בין אוכלוסיות נוירונים ספציפיות במהלך בעל חיים מתפתח.