אפיון פונקציונלי של שותפים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים במערכת העצבים המרכזית של זחל הדרוזופילה באמצעות CaMPARI
June 16th, 2026
פרוטוקול זה מעריך פעילות סינפטית פונקציונלית בין שותפים נוירונליים מוגדרים במערכת העצבים המרכזית של זחלי דרוזופילה מלנגסטר באמצעות כלים מקודדים גנטית. גירוי אופטוגנטי בתיווך CsChrimson של נוירונים סנסוריים פרה-סינפטיים cIVda מעורר פוטוקונברנסציה תלויה בסידן של CaMPARI באינטרנוירונים פוסט-סינפטיים של Basin-4.
המחקר שלנו מתמקד בהערכת קישוריות סינפטית פונקציונלית בין צמתי תא עצב מוגדרים בזחלי Drosophila חיים וחתוכים. שיטות קונבנציונליות דורשות ניתוק או גירוי פיזי. פרוטוקול זה משתמש באופטוגנטיקה בזחלים שלמים, ומפחית את הארטיפקטים.
כדי להתחיל, להמיס את מדיום אגר תירס במיקרוגל למשך 8-10 שניות ללא רתיחה ולהניח לו להתקרר בטמפרטורת החדר מבלי להתמצק. לפני הקירור המלא, להוסיף all-trans-retinal, או ATR, לריכוז של 0.5 מילימולר כדי להוסיף את המדיה לזבובים הדורשים הפעלה של csChrimson. לכסות את הבקבוקונים לחלוטין בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור.
לחצות נקבות בתולות הנושאות את הגנים CaMPARI ו-csChrimson עם זכרים הנושאים את גני הנהגים GAL4 ו-LexA בבקבוקוני פלסטיק המכילים את המדיום המוכן. להכין בקבוקונים מקבילים ללא ATR כבקרות. להדגיר את הבקבוקונים ב-25 מעלות צלזיוס עד שהזחלים מגיעים לשלב השלישי.
להשתמש במברשת כדי לאסוף זחל שלב שלישי. לשטוף את הזחל בצלחת מיקרו תלת-בארת המכילה 0.1 מולארי PBS כדי להסיר כל מזון דבק. להניח כמות קטנה של חימר דגם בכל פינה של משטח כיסוי נקי בגודל 18 על 18 מילימטר.
להניח את הזחל בטיפת PBS על משטח הכיסוי ולהניח לו להתמצב כשהצד הגחון למטה. להניח שקופה טהורה מעל משטח הכיסוי המכיל את הזחל. לאבטח את משטח הכיסוי על ידי החלת חימר דגם על הפינות, תוך שימוש בלחץ מספיק על מנת להנייד את הזחל מבלי למעוך אותו או לשבור את הזכוכית.
להניח את השקופה המכילה את הזחל על במת מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשת אובייקטיב 40x/1.2. בממשק התוכנה של המיקרוסקופ, ללחוץ על Live. ואז תחת לוח Z Stack, ללחוץ על Set First ולאחר מכן Set Last ואז Stop כדי לרכוש Z Stack בסיסי של נוירונים פוסט-סינפטיים, המביעים CaMPARI.
תחת תפריט הערוצים, להגדיר את ערוץ הירוק 488 ננומטר עם 0.8% כוח לייזר. לאחר מכן, להגדיר את ערוץ האדום 561 ננומטר ל-0.8% כוח לייזר. תחת תפריט Z Stack, להגדיר את ערך Interval ל-1 מיקרומטר.
בתפריט Acquisition, לבחור Presets כדי להגדיר את רזולוציית הפיקסלים 256 על 256. ערך ממוצע קו של 2, סריקה דו-כיוונית ומהירות סריקה של 9, המאפשרת עדכון אוטומטי של זמן הפיקסל. לבצע את כל הדימויים בסביבה חשוכה, תוך שמירה על פרמטרים זהים של רכישה לאורך כל הניסוי.
להגדיר את אור הפוטו-קונברסיה 405 ננומטר ל-0.5% כוח לייזר. ואת אור הגירוי האופטוגנטי 561 ננומטר ל-0.8% כוח לייזר. ללחוץ על Live, ואז לבחור Best Fit תחת לוח ההיסטוגרמה.
לאפשר לשני הלייזרים לגרות את הזחל בו זמנית למשך 30 שניות, ואז להפסיק את הגירוי. במהלך רכישת ZStack לאחר גירוי באותם פרמטרים כמו הבסיס, לצפות בזוהר האדום של CaMPARI בנוירונים מגורים בזחלים שניזונו מ-ATR עם פוטו-קונברסיה מינימלית ובקרות. בתוכנת התוכנה Fiji ImageJ, ללחוץ על File, ואז לבחור Open.
בחלון אפשרויות ייבוא BioFormats עם הגדרות ברירת המחדל, ללחוץ על OK כדי לפתוח את תמונת ה-ZStack שנרכשה. תחת תפריט Image, לבחור Color ולאחר מכן לחלק ערוצים כדי לצפות בערוצים האדום והירוק של התמונה שנרכשה. להפחתת רקע, ללחוץ על Process, ולאחר מכן לבחור Subtract Background.
בחלון הקופץ, להגדיר את רדיוס הכדור המתגלגל ל-50 פיקסלים ואז ללחוץ על OK ולבחור Yes בחלון Process Stack. לאחר מכן, תחת תפריט Analyze, לבחור Tools, ולאחר מכן לבחור ROI Manager כדי לפתוח את חלון ה-ROI. להשתמש בכלי הבחירה החופשית כדי לשרטט אזורי עניין סביב תאים בודדים.
בחלון ה-ROI, לבחור Add כדי לשמור את המתאר שנבחר. ואז ללחוץ על Measure כדי ליצור תוצאות שטח, ממוצע, סטיית תקן וצפיפות משולבת. לחזור על התהליך עבור תאים מרובים של
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a method to functionally validate synaptic connectivity in the Drosophila larval nervous system by combining optogenetic activation with CaMPARI-based calcium imaging. The approach enables researchers to assess activity-dependent synaptic signaling between identified sensory neurons and interneurons in intact, undissected third-instar larvae.
Key Study Components
Area of Science
- Neurobiology
- Functional connectomics
- Optogenetics
- Calcium imaging
Background
- Connectome studies have mapped synaptic connectivity in various species, including Drosophila.
- Electron microscopy provides detailed anatomical data but lacks functional information.
- Recent Drosophila research has identified key neuronal networks underlying specific behaviors, such as nociception.
- Class IV dendritic arborization (cIVda) sensory neurons form major synaptic contacts with Basin-4 interneurons by the third instar larval stage.
Purpose of Study
- To functionally assess synaptic connectivity between cIVda nociceptors and Basin-4 interneurons in Drosophila larvae.
- To demonstrate the utility of CaMPARI as an activity-dependent reporter in live, undissected larvae.
- To establish a proof-of-principle protocol combining optogenetic stimulation and CaMPARI photoconversion.
Methods Used
- Immobilization of third-instar Drosophila larvae on microscope slides.
- Optogenetic activation of cIVda nociceptors using the red-shifted channelrhodopsin CsChrimson.
- Simultaneous CaMPARI photoconversion in Basin-4 interneurons to detect calcium influx.
- Fluorescence imaging to monitor CaMPARI color change as a readout of synaptic activity.
Main Results
- Calcium-dependent photoconversion of CaMPARI was observed in Basin-4 interneurons following optogenetic stimulation of cIVda neurons.
- The method provided functional evidence of synaptic connectivity despite internal larval movements and focal plane changes.
- The approach validated the anatomical connections identified by connectome studies with functional data.
Conclusions
- CaMPARI-based photoconversion is a reliable indicator of synaptic activation in intact Drosophila larvae.
- The protocol enables functional validation of connectomic data in vivo.
- This method can be broadly applied to study neuronal network function in genetically tractable organisms.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Functional validation of synaptic connectivity is critical for de-risking target selection and advancing mechanistic understanding in neurobiology-driven drug discovery. This CaMPARI-based approach enables direct assessment of activity-dependent signaling between defined neuronal partners in intact systems, bridging the gap between anatomical connectomics and actionable functional data. Such methods enhance predictive confidence at the target validation and early discovery inflection points, supporting portfolio decisions in CNS and neurodevelopmental pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of functional synaptic connectivity beyond anatomical mapping.
- Supports mechanistic de-risking by confirming physiologically relevant neuronal interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of validated, activity-dependent readouts for neuronal assays.
- Provides quantitative, ratiometric outputs suitable for reproducible screening workflows.
- Enables robust assay standardization by integrating optogenetic stimulation with functional imaging.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional synaptic data with disease-relevant neural circuits in preclinical models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking connectomic and functional endpoints.
- De-risks translational biomarker strategies by confirming in vivo neuronal activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through assay development and preclinical research, providing a reusable platform for functional connectomics in genetically tractable systems.
- Discovery Biology: Validates synaptic function and pathway engagement in intact neural circuits.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables ratiometric measurement of calcium-dependent activity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges anatomical and functional data to inform disease-relevant model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable workflow adaptable to diverse neuronal targets and circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes functional readouts and supports reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes targets with validated functional relevance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of CNS and neurodevelopmental programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, calcium imaging, and genetic model systems.
- Needs fluorescence microscopy infrastructure and precise light delivery systems.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data interpretation.
- Adaptation to other model systems depends on genetic tractability and optical accessibility.
- Internal movement and focal plane changes in live imaging must be managed for reliable outputs.