שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי ניתן לאימות חלבונים המקיימים אינטראקציה ישירה עם LncRNA: מתאים מתורבתים לאשך עכבר

המחקר שלנו פיתח את cPDiRT, שיטת קישור צולב (cross-linking) באמצעות UV למיפוי ישיר של אינטראקציות בין RNA לחלבונים הן בתאים מתורבתים והן ברקמות טבעיות, כגון אשכים, ובבדיקת המנגנונים המולקולריים של TUG1 בספרמטוגנזה. פרוטוקול זה מאפשר מיפוי ישיר של אינטראקציות בין RNA לחלבונים במגוון רחב של מערכות, החל מתאים מתורבתים ועד לרקמות טבעיות שלמות. כדי להתחיל, שטפו את תאי ה-GC2 שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר שאריות של מצע תרבית.

לאחר מכן, הוסיפו שלוש מיליליטר של PBS לכלי והפיצו אותו באופן שווה לפני הקשירה הצולבת (cross-linking). הקרינו את התאים במכשיר לקשירה צולבת בעזרת אור על-סגול באורך גל של 254 ננומטר במינון של 4,000 מיליג'ול לסמ"ר. אספו את התאים ב-PBS וסבבו את תרחיף התאים בצנטריפוגה ב-3000G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), שקלו את המשקע ואשרו כי מסת המשקע היא לפחות 500 milligrams לדוגמה. אספו אשכים מעכברי C57BL6 זכרים בני ארבעה שבועות. שטפו את רקמת האשכים לאחר הסרת העטיפה פעמיים עם 5 עד 10 milliliters של DMEM.

לאחר מכן, דגרו 100 milligrams של רקמה עם 10 milliliters של DMEM המכיל one milligram per milliliter collagenase IV בטמפרטורה של 37 °C. המשיכו בעיכול במשך 5 עד 15 דקות עד לשחרור הצינורות המנקבים (seminiferous tubules). לאחר מכן, סובבו את התוך בcenterY ב-1000G למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 °C והסירו את העילוי.

שטפו את המשקע עם 5 עד 10 milliliters של DMEM. סבבו את התוך-סלולית שוב בצנטריפוגה ב-1000G למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. ושבבו את המשקע ב-0.25% trypsin המכיל מיליגרם אחד ל-milliliter של deoxyribonuclease I. דגרו את התוך-סלולית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 עד 15 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו נפח שווה של DMEM המועשיר ב-10%FBS כדי לעצור את העיכול האנזימטי. סננו את התרחיף דרך מסנן תאים של 70 מיקרומטר. צנטריפוגו את התאים ב-2000G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

יש להשליך את הנוזל העליון ולשטוף את המשקע עם 5 עד 10 milliliters של PBS. יש לצנטריפוג את התמיה שוב ב-2000G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. יש להשעות מחדש את תרחיף התאים הבודדים ב-PBS ולחלק אותו באופן שווה על פני צלחת תרבית של 15 סנטימטרים.

בצעו קשירה צולבת (Cross-link) לתאי האשכים כפי שהודגם קודם לכן עבור תאי GC2. השמיטו את ההקרנה עבור תאי הבקרה. אספו את התאים שעברו קשירה צולבת.

סנטריפוגו את התרחופף ב-3000G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הנוזל העליון. ודאו שמסת המשקע היא לפחות 500 מיליגרם על ידי איסוף תאי אשכים שבודדו מלפחות 10 עד 12 עכברים. לאחר שקילת המשקע, השעילי אותו שוב בבופר לליזה של תאים ביחס של 100 מיליגרם משקע לכל מיליליטר אחד של בופר.

לאחר ערבוב ב-vortex, בצעו סוניקציה לדגימה באמצעות סוניקטור ממוקד או מכשיר סוניקציה בגישראמ באמבט מים עד שהליזאט יהיה צלול באופן חזותי. לאחר מכן, העבירו מנות של כ-10 µL מהליזאט למבחנות מיקרוצנטריפוגה לצורך אנליזת RNA וחלבונים. הוסיפו 30 µL של חרוזי מגנט שנשטפו מראש לליזאט.

דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות עם ערבוב עדין בתנור היברידיזציה. הניחו את הדגימות על מעמד מגנטי למשך כדקה או עד שהתמיסה תהפוך לצלילה. העבירו את הליזט הצלול למבחנה חדשה.

הנח את המבחנה החדשה על המעמד המגנטי. לאחר מכן, העבר את הליזאט למבחנה אחרת כדי להסיר חרו지를 שאריות. הוסף לכל דגימה שני נפחים של בופר היברידיזציה שחומם ל-37 °C.

הוסיפו גששי DNA מבו-ביוטין ביחס של מיקרוליטר אחד של תמיסת גשש ריכוז 100 micromolar לכל מיליליטר של ליזט. הדגירו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C תוך סיבוב רציף (end-over-end rotation) למשך 12 עד 16 שעות בתנור היברידיזציה. מיד לפני השימוש, שטפו 100 microliters של חרוזי מגנט סט렙טאווידין שלוש פעמים עם בופר לליזיס תאים.

והסרו את שארית התמיס (buffer) לאחר השטיפה האחרונה. צנטריפגו קלות את מבחנות תגובת ההיברידיזציה. לאחר מכן, הוסיפו את הדגימה שעברה היברידיזציה אל החרוזיים השטופים ועזבזו בעדינות.

החזירו את תרחיף החרוזים למבחנה המקורית והדגירו בטמפרטורה של 37 °C תוך ערבוב למשך 30 עד 40 דקות. לאחר הדגירה, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה לזמן קצר. הניחו את המבחנות על מעמד מגנטי למשך דקה אחת עד שתי דקות, או עד שהתמיסה תהפוך שקופה.

לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון (supernatant). כדי לשטוף את החרוזים, הוסיפו 1 mL של תמיסת השטיפה והדגירו את המבחנות בתנור ההכלה (hybridization oven) בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות. לאחר חמישה סבבי שטיפה, העבירו 1-10% מהחרוזים למבחנה נקייה לצורך אנליזת RNA.

לבסוף, הוסיפו 40 µL של תחבירי דגימה SDS 1X לחרוזים שנותרו. הרתיחו את הדגימות בטמפרטורה של 95 °C למשך 30 דקות כדי לשחרר את החלבונים ולהפוך את הקשרים הצולבים. אספו את החלבונים לצורך אנליזת ספקטרומטריית מסות בהמשך.

ניתוח ספקטרומטריית מסות מסוג ChIRP זיהה יותר מ-190 חלבונים שהועשרו ביחס לבקרת השלילה בתאי GC2. במינון UV של 4,000 millijoules per square centimeter, שיטת cPDiRT-MS זיהתה סט חלבונים סלקטיבי יותר. יותר משני שלישים מחלבונים אלו חפפו לאלו שזוהו על ידי ChIRP-MS קונבנציונלי.

מרבית החלבונים שזוהו עם לפחות שני פפטידים ייחודיים גולו באופן הדיר במישחאות ביולוגיות הן בתאי GC2 והן באשכים של עכברים. ניתוח אונטולוגיה של גנים (Gene ontology) של החלבונים שזוהו באופן הדיר חשף תהליכים ביולוגיים העולה בקנה אחד באופן רחב עם התפקודים הידועים של TUG1. השוואה בין מערכי הנתונים של תאי GC2 ואשכי עכברים זיהתה 15 חלבונים שהיו מועשרים באופן משותף.

ריצוף של אימונו-שיקוע עם קשירה צולבת משופרת (Enhanced cross-linking immunoprecipitation sequencing) חשף שיאי קישור ברורים וספציפיים של PABPC1 ו-CCT3 על התמלופה של TUG1. שיטת cPDiRT מאפשרת לחוקרים לזהות ולמדוד חלבונים המקיימים אינטראקציה ישירה עם RNA מקושר ספציפי, הן בתאי תרבית והן ברקמות טבעיות. האתגר המרכזי הוא השגת קשירה צולבת יעילה באמצעות UV, תוך הבטחת ספציפיות גבוהה לאינטראקציות ישירות בין ה-RNA לחלבון.

הפרוטוקול שלנו יתמוך במחקרים עתידיים ליישום גישה זו על RNA אחר ועל רקמות, במטרה להבין את תפקידם הישיר של חלבוני RNA בפעילות במהלך ההתפתחות והרבייה.