ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר Shital Suryavanshi ולצוות בית החיות של ה-Tata Institute of Fundamental Research על תמיכתם המצוינת. אנו מודים לד"ר Sundar Naganathan על שאיפשר בנדיבות את השימוש במיקרוסקופ הסטריאו-מאקרו-זום Olympus MVX10 במעבדתו לצורך הקלטת הווידאו של הפרוצדורה. עבודה זו מומנה על ידי מענק מה-Department of Atomic Energy (DAE), ממשלת הודו, מספרי זיהוי פרויקטים RTI403 ו-RTI4015 (ST); מענק ICMR-DHR SUG, GAP0303, ומענק ANRF PMECRG, GAP0313 (AP).

כל ההליכים אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות ועדת אתיקה לבעלי חיים המוסדית של Tata Institute of Fundamental Research.
1. הכנת החומרים
<ol>
	<li>יש לוודא שכל המכשירים הדרושים למיקרו-דיסקציה (ראו את טבלת החומרים) מוכנים לפני הפרוצדורה. יש לעקר את כל המכשירים באמצעות 70% ethanol. עבור איסוף דגימות ליישומים המשכיים כגון טרנסקריפטומיקה מרחבית/היברידיזציה in situ, יש לנגב את המכשירים בתמיסת דה-קונטמינציה ל-RNase.</li>
	<li>יש לנקות את בסיס מיקרוסקופ הדיסקציה בתמיסת דה-קונטמינציה ל-RNase ולהחזיק בקבוק של 1× PBS קר במקרר בהישג יד ליד שולחן הדיסקציה.</li>
	<li>יש להכין את המכשירים והכלי הפלסטיים הבאים לפני פרוצדורה זו:
	<ol>
		<li>להכנת בעל החיים, יש להכין את הדברים הבאים: 2 זוגות פינצטות קהות, זוג מספריים כירורגיים, 2 צלחות פטרי (10 cm), ומספר צלחות פטרי (6 cm; לפי הצורך, אחת לכל ראש).</li>
		<li>לבידוד המוח, יש להכין את הדברים הבאים: זוג פינצטות #5, זוג פינצטות #5, זוג מספרי מיקרו-דיסקציה, ומבחנות/צלחות איסוף המתאימות ליישום ההמשכי.</li>
		<li>הערה: אם היישום ההמשכי כולל היברידיזציה in situ או טרנסקריפטומיקה מרחבית, יש לנקות את מכשיר הדיסקציה בתמיסת דה-קונטמינציה ל-RNase לפני השימוש.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. הכנת בעלי החיים
<ol>
	<li>בצעו את השלבים (2.1.1– 2.1.6) עבור חיות בשלבים E14.5–P0
	<ol>
		<li>בצעו המתנזיה לנקבה ההרה בהתאם להנחיות ועדת אתיקה לבעלי חיים מוסדית. בדוגמה המוצגת, ההמתנזיה בוצעה על ידי פריקה של חוליות הצוואר.</li>
		<li>בצעו חתך בקו האמצע של חל הבטן של הנקבה ההרה כדי לחשוף את הרחם. באמצעות פינצטה קהה, שלפו בעדינות את קרני הרחם והניחו אותן בצלחת סטרילית של 10 cm המכילה 1×&#160;PBS קר מאוד.</li>
		<li>בודדו בזהירות כל עובר בנפרד על ידי הפרדתו משקית השית ומהשלייה שסביבו.&#160;</li>
		<li>העבירו את העוברים לצלוחית פטרי נקייה של 10 cm המכילה 1× PBS קר מאוד ושמרו אותם על קרח עד שכל אחד מהם יילקח לבידוד המוח. העבירו עובר בודד לצלוחית פטרי של 6 cm המכילה PBS קר מאוד.&#160;</li>
		<li>עבור שלבים פוסט-נטאלים עד P7, בצעו המתנזיה לגור בהתאם להנחיות ועדת אתיקה לבעלי חיים מוסדית. לאחר מכן המשיכו משלב 2.1.6 ואילך.</li>
		<li>באמצעות מספריים כירורגיים, הפרידו את הראש מהגוף באופן שבו המוח האחורי נשאר בחלק של הראש כדי להגן על המוח הקדמי מפני נזק מקרי.</li>
		<li>שטפו את הראש ב-PBS קר להסרת הדם. העבירו לצלוחית פטרי נקייה של 6 cm המכילה 1× PBS קר מאוד. השאירו את הראש טבול ב-PBS כדי לאפשר שטיפה של דם ושאריות במהלך שלבי הניתוח הבאים.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. פרוצדורת נתיחה לבידוד המוח עם בלוטת האצטרובל שלמה
הערה: יש לבצע את כל השלבים להלן באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה. כווננו את ההגדלה ל-2× לפחות (או לפי הצורך) כדי להבחין בבירור במוח ובמבנים הסובבים אותו לאורך כל הדיסקציה. יש לבצע את כל תהליך הדיסקציה ב-PBS קר מאוד (בטמפרטורת קרח) כדי למזער את הפירוק של RNA וחלבונים. בשלבים 3.1–3.10, השתמשו ביד הלא-דומיננטית כדי להחזיק את הראש בצורה איתנה ולייצב אותו לאורך הפרוצדורה בהתאם להוראות בשלב 3.1. את שלבים 3.2–3.9 יש לבצע כאשר היד הלא-דומיננטית מייצבת את הראש, והיד הדומיננטית משמשת לביצוע פעולות עדינות, תחילה באמצעות פינצטה מסוג #5, ולאחר מכן במעבר לפינצטה מסוג #55 או למספרי מיקרו-דיסקציה כפי שצוין עבור כל שלב.&#160;
<ol>
	<li>השתמש בפינצטה מס' 5 ביד הלא-דומיננטית. הכנס את שתי השיניים אל שקעי העיניים בתנועה נחרצת כלפי מטה. שמור על לחץ כלפי מטה כדי לקבע את המוח לתחתית צלחת הפטרי עד לסיום שלב 3.9.&#160; 
	הערה: המוח מונח מעל שקעי העיניים ואינו מושפע מהכנסת הפינצטה לשקעי העיניים. שמירה על לחץ קבוע כלפי מטה מייצבת את המוח לאורך כל תהליך הנתיחה.&#160;</li>
	<li>באמצעות היד הדומיננטית, תלוש והסר את העור המכסה את הראש בעזרת פינצטה מס' 5.&#160; 
	הערה: בשלב זה, ניתן לראות את ה-chondrocranium החלק המכסה את המוח.</li>
	<li>הסר את חלק ה-chondrocranium המכסה את המוח האמצעי והמוח האחורי באופן הבא:
	<ol>
		<li>השתמש בפינצטה מס' 5 כדי לבצע שתי חתכים חודרים ב-chondrocranium משני צידי המוח האמצעי, בדיוק בנקודת המפגש שלו עם ה-telencephalon.</li>
		<li>החלק שן אחת של פינצטה מס' 5 באופן משיקי תחת ה-chondrocranium לאורך הקו המשיקי הדמיוני המפריד בין ה-telencephalon למוח האמצעי. אחז חזק וקרע את ה-chondrocranium.</li>
		<li>המשיך בהסרת ה-chondrocranium כך שהמוח האמצעי והמוח האחורי ייחשפו.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>עבור לשימוש בפינצטה מס' 5. הכנס שן אחת בדיוק מתחת לשפה של השוליים הזנביים (caudal) של ה-chondrocranium המכסה את ה-telencephalon. הפרד בעדינות את ה-chondrocranium על ידי ניתוק所有 קשרים עם רקמות כלי דם וקרומי מוח (meningeal).</li>
	<li>בעזרת מספרי מיקרו-דיסקציה, חתוך לאורך קו האמצע הגבי של ה-telencephalon לכיוון הבצלול (olfactory bulb). בעזרת פינצטה מס' 55 סגורה, נקה בעדינות את כל ההיצמדויות של ה-chondrocranium למוח. הפרד בין שני חלקי ה-chondrocranium המכסים את המיספרות של ה-telencephalon בעזרת פינצטה מס' 5. 
	הערה: בשלב זה, ניתן לראות את ה-SSS כוריד אדום כה לאורך השוליים העליונים של ה-chondrocranium במוח, ואת ה-TS נראה בניצב ל-SSS.</li>
	<li>בלוטת האצטרובל (pineal gland) נמצאת ממש מתחת ל-SSS. בצע חתך בקצה הרוסטרלי (rostral) של ה-SSS בעזרת מספרי מיקרו-דיסקציה.&#160;</li>
	<li>בעזרת פינצטה מס' 5, הסר לחלוטין את החלק הגבי של ה-chondrocranium מכל צד כדי לחשוף טוב יותר את בלוטת האצטרובל, את ה-SSS ואת ה-TS.</li>
	<li>בצע שני חתכים ב-TS משני צידי בלוטת האצטרובל, בעזרת מספרי מיקרו-דיסקציה. בעזרת פינצטה מס' 5, נתק את ההיצמדויות הלטרליות של ה-TS.&#160;</li>
	<li>בעזרת פינצטה מס' 5 סגורה, שחרר בעדינות את החלק הרוסטרלי של המוח מהקמרה הגולגולתית הוונטרלית. החלק את הפינצטה הסגורה תחת הצד הוונטרלי של המוח ושחררו לחלוטין.&#160;</li>
	<li>שמור את המוח כשהבלוטה האצטרובלית שלמה, בהתאם לדרישות יישומי המשך.</li>
</ol>
4. שלבים קריטיים בפרוטוקול
הערה: הצלחתו של פרוטוקול נתיחה זה תלויה בטיפול זהיר בחיבורים כלי הדם המקיפים את בלוטת האצטרובל. הנקודות הבאות הן קריטיות לשמירה על שלמות בלוטת האצטרובל לאורך הליך הנתיחה:
<ol>
	<li>ייצבו את הראש על ידי החדרת שיני פינצטה מסוג #5 לשני שקעי העיניים ושמרו על לחץ כלפי מטה חזק לאורך שלבים 3.1–3.9. פעולה זו מספקת תמיכה יציבה תוך הימנעות מלחץ ישיר על המוח.</li>
	<li>במהלך הסרת הכונדרוקרניום (שלב 3.3), הימנעו מפעולות משיכה או קילוף מרובות, שכן אלו עלולות להוביל לניתוק בלוטת האצטרובל מהדיאנצפאלון הגבי.</li>
	<li>במהלך ניקוי ההצמדות המנינגיאליות והכליים (שלב 3.4), ובזמן פתיחת הכונדרוקרניום התלנצפלי הגבי (שלב 3.5), השתמשו אך ורק בקצוות של פינצטה מסוג #5. חדירה עמוקה של הפינצטה עלולה לפגוע בבלוטת האצטרובל, השוכנת מיד מתחת לגג התלנצפאלון הזנבי.</li>
	<li>השלימו את חיתוך הסינוס הסגיטלי העליון (שלב 3.6) ואת החיתוך הדו-צדדי של הסינוס הרוחבי (שלב 3.8) לפני הוצאת המוח. חיתוכים אלו מקלים על המתח בתוך הרשת הוורידית הגבית ומונעים קריעה של בלוטת האצטרובל במהלך הוצאת המוח.</li>
	<li>בשלב 3.9, שחררו בעדינות את המוח באמצעות פינצטה סגורה מבלי להביא להפרעה של קו האמצע הגבי. המוח אמור להיפרד בחופשיות מקשת הגולגולת ברגע שכל ההצמדות המנינגיאליות והכליים שוחררו.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nakahara D, Nakamura M, Iigo M, Okamura H. Bimodal circadian secretion of melatonin from the pineal gland in a living CBA mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(16):9584-9.</li>
	<li>Christ E, Pfeffer M, Korf HW, von Gall C. Pineal melatonin synthesis is altered in Period1-deficient mice. Neuroscience. 2010;171(2):398-406.</li>
	<li>Rath MF. Homeobox gene-encoded transcription factors in development and mature circadian function of the rodent pineal gland. J Pineal Res. 2024;76(3):e12950.</li>
	<li>Rath MF, Rohde K, Klein DC, M&#248;ller M. Homeobox genes in the rodent pineal gland: roles in development and phenotype maintenance. Neurochem Res. 2013;38(6):1100-12.</li>
	<li>Estivill-Torr&#250;s G, Vitalis T, Fern&#225;ndez-Llebrez P, Price DJ. The transcription factor Pax6 is required for development of the diencephalic dorsal midline secretory radial glia that form the subcommissural organ. Eur J Neurosci. 2001;14(6):1011-22.</li>
	<li>Dias M, et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 2021;8(4):ENEURO.0146-21.2021.</li>
	<li>Matsunaga MM, et al. Morphologic analysis of mice&#39;s pineal gland. J Morphol Sci. 2011;28(3):157-60.</li>
	<li>Boeckmann D. Morphological investigation of the deep pineal of the rat. Cell Tissue Res. 1980;210(2):283-94.</li>
	<li>Parichha A, et al. Constitutive activation of canonical Wnt signaling disrupts choroid plexus epithelial fate. Nat Commun. 2022;13:633.</li>
	<li>Parichha A, et al. Dentate gyrus morphogenesis is regulated by &#946;-catenin function in hem-derived fimbrial glia. Development. 2022;149(21):dev200953.</li>
	<li>Sparks DL, Coyne CM, Sparks LM, Hunsaker JC 3rd. Recommended technique for brain removal to retain anatomic integrity of the pineal gland in order to determine its size in sudden infant death syndrome. J Forensic Sci. 1997;42(1):100-2.</li>
	<li>Bowyer JF, et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. J Vis Exp. 2012;69:e4285.</li>
	<li>Calvo J, Boya J. Embryonic development of the rat pineal gland. Anat Rec. 1981;200(4):491-500.</li>
</ol>

כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.

שיטות סטנדרטיות לדיסקציה של בלוטת האצטרובל (pineal gland) פותחו עבור מוח של עובר או תינוק אנושי, ובכך הן מסייעות לפתולוגים פורנזיים בהבנת הגורם לתסמונת מוות פתאומי של תינוקות1. פרוטוקולים קודמים הדגימו הסרה של בלוטת האצטרובל יחד עם כלי דם שטחיים, קרומי המוח והפלקס כורואידס (choroid plexus)12; עם זאת, לא תוארו שיטות להשגת שימור אמין של בלוטת אצטרובל שלמה המחוברת לגג הדיאנצפאלון (diencephalic roof) במהלך שלבים מוקדמים של התפתחותה בעכברים או במכרסמים אחרים.
חלק ניכר מהספרות האנטומית והמתודולוגית הקלאסית המתארת פינאלקטומי (pinealectomy) ואנליזה פותח באמצעות מודלים של חולדות13, שבהן הבלוטה גדולה יותר וקל יותר לזיהוי. לעומת זאת, בלוטת האצטרובל של העכבר קטנה משמעותית ושבירה יותר, מה שהופך אותה לרגישה במיוחד לאובדן או לנזק במהלך הליכים שגרתיים של הוצאת המוח. מספר מחקרים ניסו להתמודד עם אתגר זה על ידי קיבוע המוח בתוך הראש כולו. עם זאת, גישה זו יוצרת מגבלות טכניות נוספות במהלך הכנת הרקמה לחיתוך. לדוגמה, במהלך קריו-הגנה ב-30% sucrose לאחר קיבוע ב-4% paraformaldehyde, קשת הגולגולת עלולה להפעיל לחץ על רקמת המוח שמתחתיה, מה שמוביל לדחיסה או לעיוות של מבני המוח הקדמי הגביים (dorsal forebrain). ארטיפקטים כאלה עלולים לפגוע במורפולוגיה של המוח ולסבך אנליזות המסתמכות על ארגון אנטומי מדויק. יתרה מכך, קיבוע הרקמה עשוי שלא להתאים לכל היישומים. לכן, נדרשות שיטות המשמרות את בלוטת האצטרובל ושומרות על היצמדותה לגג הדיאנספאלון (diencephalon) מבלי לפגוע בשלמות המוח הכללית, כדי להקל על מחקרים התפתחותיים ומולקולריים של בלוטת האצטרובל בעכבר.
שימור מהימן של בלוטת האצטרובל בpreparations של מוח שלם הוא חשוב עבור מספר יישומים ניסויים. גישות היסטולוגיות ומולקולריות, כגון immunohistochemistry ו- in situ hybridization, דורשות שימור של ארכיטקטורת הרקמה כדי לבחון ביטוי גנים וארגון תאי בתוך הבלוטה. לאחרונה, טכנולוגיות מתפתחות כגון spatial transcriptomics ושיטות אחרות של פרופיילינג מולקולרי ברזולוציה מרחבית מסתמכות אף הן על מורפולוגיית רקמה שלמה כדי למפות ביטוי גנים בתוך הקשרים אנטומיים ספציפיים. נכון להיום, לא דווח על מפת spatial transcriptomic של בלוטת האצטרובל של עכבר עוברי. ייתכן כי הדבר משקף, בחלקו, את הקושי הטכני בשימור בלוטת האצטרובל שלמה במהלך דיסקציה קונבנציונלית של המוח. לכן, שיטות השומרות באופן מהימן על שלמות בלוטת האצטרובל צפויות להקל על יישומן של גישות spatial transcriptomic מתפתחות בביולוגיה של בלוטת האצטרובל. בנוסף, מכיוון שבלוטת האצטרובל מהווה חלק קטן מאוד מסך רקמת המוח, בידוד המוח כאשר בלוטת האצטרובל שלמה מאפשר שלב נוסף של איסוף ספציפי של בלוטת האצטרובל, ואיסוף מצטבר של דגימות כאלה ישפר משמעותית את ההעשרה של ייצוג ספציפי לאצטרובל בניתוחים מסוג bulk במחקרי טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה.
יש לייצב היטב את הראש באמצעות פינצטה מס' 5 ביד הלא-דומיננטית. יש לשמור על ייצוב זה לאורך כל תהליך הנתיחה; לפיכך, על היד הדומיננטית לנהל את החלפת המכשירים לפי הצורך. כווננו את התאורה כדי לראות טוב יותר את ההיצמדות של בלוטת האצטרובל לרקמה הווסקולו-מנינגיאלית העוטפת אותה, אותה יש להסיר.

הבלוטה האפיתלית (pineal gland) היא מבנה נוירואנדוקריני קטן הממוקם בקו האמצע הגבי של מוח חולייתנים, והיא ממלאת תפקיד מרכזי בויסות הפיזיולוגיה הצירקדית באמצעות הפרשה מחזורית של מלטונין1,2. במהלך האמבריוגנזה של יונקים, הבלוטה האפיתלית נוצרת מקו האמצע הגבי של המוח הקדמי המתפתח. בעכברים, התפתחות הבלוטה האפיתלית מתחילה כאשר אזור מיוחד של הנוירואפיתל הדיאנצפלי הגבי יוצר את ה-pineal anlage/pineal recess, אשר בעקבות זאת מבצע מבליטה (evagination) ליצירת ה-pineal diverticulum ביום עוברי (E) 14.53,4,5. דיברטיקולום זה מחובר לתקרת הדיאנצפאלון ונראה בין השקיקים הטלנצפליים הזוגיים. ככל שההתפתחות נמשכת, דיברטיקולום זה הופך לקשור באופן הדוק למבנים העלונים בקו האמצע הגבי של המוח, ובמיוחד לסינוס הסגיטלי העליון (SSS) ולסינוס הרוחבי (TS), שהם תעלים ורידיים העוברים לאורך פניו הגביים של המוח הקדמי6. הבלוטה האפיתלית המתפתחת שוכנת מיד מתחת למפגש שבין ה-SSS ל-TS, והחיבור העדין שלה לדיאנצפאלון הגבי פגיע במיוחד כאשר המבנים הווסקולו-מנינגיאליים העלונים מוסרים כדי להוציא את המוח מתוך קמני הגולגולת7. עובדה זו הופכת את הבלוטה האפיתלית לרגישה במיוחד לנזקים, שכן היא עלולה להיקרע בעת פתיחת קמני הגולגולת לצורך הוצאת המוח. כתוצאה מכך, הבלוטה האפיתלית אובדת לעיתים קרובות במהלך נתיחות שגרה, דבר המגביל את ניתוח המבנה וההרכב המולקולרי שלה בדגימות שלמות.
כאן אנו מתארים פרוטוקול שלב-אחר-שלב לדיסקציה של מוח עכבר תוך שימור בלוטת האצטרובל (pineal gland) והחיבור שלה לגג הדיאנספאלון (diencephalon). השיטה ישימה לשלבים עובריים החל מ-E16.5 ועד לשלבים פוסט-נטאלים מוקדמים (P7), והיא מתאימה למחקרים של התפתחות בלוטת האצטרובל באמצעות היברידיזציה in situ, אימונוהיסטוכימיה וטרנסקריפטומיקה מרחבית. כהדגמה של יישומים המשכיים, מוצגות היברידיזציה in situ ואימונוהיסטוכימיה עבור הסמן CRX המועשר בבלוטת האצטרובל.
החידוש המרכזי בשיטה זו הוא צמצום העומס על מבני קו האמצע על ידי הסרה זהירה של חיבורים פיזיים שאלמלא כן היו גורמים לקריעת בלוטת האצטרובל בעת הוצאת המוח מהגולגולת. זהו שיפור לעומת הפרוצדורה הסטנדרטית.
שיטת הניתוח זו מוגבלת לשלבים עד P7 מכיוון שההסמכה (ossification) הדרגתית של קמרה הגולגולת במהלך ההתפתחות הפוסטנטלית המוקדמת מגבירה את קשיחות הגולגולת ומחזקת את הקשרה למבנים וסקולריים וקרומיים. בעוד שמספר מחקרים תיארו הליכי ניתוח של בלוטת האצטרובל במכרסמים בוגרים8, מעטים מאוד התמקדו בשימור בלוטת האצטרובל במהלך השלבים העובריים והפוסטנטליים המוקדמים, כאשר הבלוטה שברירית במיוחד ופגיעה לנזק במהלך בידוד המוח.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ שדה בהיר (Brightfield)</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>כל מיקרוסקופ שדה בהיר עם מצלמה צבעונית הוא מתאים.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקאלי</td><td>Olympus</td><td>FV300</td><td>כל מיקרוסקופ קונפוקאלי או מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה הוא מתאים, בהתאם לרזולוציה הנדרשת</td></tr><tr><td>נוגדן CRX</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-32182</td><td>פרוטוקול צביעה אימונוהיסטוכימית המתואר ב-Parichha et al.&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>גשמי ת CRX</td><td>Custom made</td><td>Custom made</td><td>פרוטוקול היברידיזציה במקום (in situ hybridization) לפי Parichha et al.&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>פינצטה עדינה&amp;nbsp;# 5</td><td>F.S.T</td><td>1251-23</td><td>ניתן להחליף בכלים דומים מכל חברה.</td></tr><tr><td>פינצטה עדינה&amp;nbsp;# 55</td><td>F.S.T</td><td>125-20</td><td>ניתן להחליף בכלים דומים מכל חברה.</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>1010023</td><td>ניתן להחליף בפריטים דומים מכל חברה.</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>Corning</td><td>CLS351029</td><td>ניתן להחליף בפריטים דומים מכל חברה.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9782</td><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution הוא תמיסה לדיסאינפקציה של משטחים המשמידה RNases במגע&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים עם קפיץ (מספריים למיקרו-דיסקציה)</td><td>F.S.T</td><td>15020-15</td><td>ניתן להחליף בכלים דומים מכל חברה.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו-זום</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>כל מיקרוסקופ דיסקציה הוא מתאים</td></tr></tbody></table>

שימור בלוטת האצטרובל בהכנות של מוח עכבר בתקופה הפרינטלית

Preserving the Pineal Gland in Perinatal Mouse Brain Preparations

הבלוטה האצטרובלית, מבנה נוירואנדוקריני המפריש מלטונין, נוצרת מרקמה ראשונית (anlage) בקו האמצע הגבי של המוח הקדמי העוברי. ביום עוברי (E) 14.5 בעכבר, נראה דיברטיקולום אצטרובלים הבולט החוצה מגג הדיאנצפאלון בין השקיקים הטלנצפאלים הזוגיים. דיברטיקולום זה נמצא במגע הדוק עם רקמת סחוס, קרומי מוח ורקמה וסקולרית העלונות לו. קל לאבדו אותו כאשר פותחים את קמחרת הגולגולת כדי להוציא את המוח בשלבים עובריים מאוחרים או בשלבים פוסט-נטאלים מוקדמים. למרות תפקידה הנוירואנדוקריני החשוב, ההתפתחות המוקדמת של הבלוטה האצטרובלית ומנגנוני האיתות המווסתים תהליך זה נותרו לא מובנים דיו, בין השאר בשל הקושי לשמר מבנה זה שלם במהלך השלבים העובריים של התפתחות מוח העכבר.
מאמר זה מציג פרוצדורת ניתוח חדשנית המשמרת את בלוטת האצטרובל (pineal gland) תוך שמירה על שלמותה המבנית ועל חיבורה לתקרת הדיאנצפאלון (diencephalon) במהלך בידוד המוח משלבים עובריים ועד ליום postnatal (P) 7. הפרוצדורה מודגמת באמצעות מוח עכבר E18.5 ולכן היא מתאימה ליישומים המשכיים הדורשים שימור של ארכיטקטורת הרקמה, כולל היברידיזציה in situ, אימונוהיסטוכימיה וטרנסקריפטומיקה מרחבית. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה גם לבידוד בלוטת האצטרובל המתפתחת, ובכך לשפר את הייצוג הספציפי של הבלוטה בניתוחים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים, דבר המהווה אתגר בשל גודלה הקטן.

פרוטוקול נתיחה זה מאפשר בידוד עקבי של מוחות עכברים עובריים ומקצבי postnatal מוקדמים מ-E16.5–P7, כאשר בלוטת האצטרובל נשמרת במיקומה האנטומי הטבעי (איור 1).
הסרה שלבית של ה-chondrocranium, בשילוב עם ניקוי זהיר של היצמדות קרומיות וכלי דם, מונעת מאמץ גזירה מקרי על בלוטת האצטרובל. יתרה מכך, חיתוך מבוקר של ה-superior sagittal sinus (SSS) בקצהו הרוסטרלי, יחד עם חיתוכים דו-צדדיים ב-transverse sinus (TS), משחררים ביעילות את המתח ברשת כלי הדם הדורסלית. פעולה זו מגנה על בלוטת האצטרובל מפני קריעה במהלך הוצאת המוח העוקבת. כתוצאה מכך, בלוטת האצטרובל נותרת שלמה ומחוברת לקו האמצע של ה-diencephalon לאחר בידוד המוח מהקמירה הגולגולתית (איור 2A).
כדי לבחון את שלמותה של בלוטת האצטרובל המשומרת ואת התאמתה ליישומים עוקבים, בוצעו היברידיזציה in situ עבור הסמן של בלוטת האצטרובל Crx, ואימונוהיסטוכימיה עבור חלבון CRX9,10(איור 2B–D). פעולה זו אישרה את זהותה ואת השלמות המבנית של בלוטת האצטרובל.
פרוטוקול הניתוח תוקף במספר שלבי התפתחות, וברוב המכריע של הניסויים נשמרה בלוטת האצטרובל בשלמותה: E16.5 (N = 10), E18.5 (N = 15), P0 (N = 10), ו-P7 (N = 6). הדבר מוכיח כי השיטה היא חסונה ובעלת הדירות גבוהה לשימור בלוטת האצטרובל במהלך בידוד המוח בשלבים עובריים ובשלבים מוקדמים לאחר הלידה (איור 2E).
<img alt="תרשים טכניקת מיקרו-דיסקציה: תהליך הסרת ה-chondrocranium באמצעות פינצטה ומספריים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71934/71934fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="איור 1"> 
איור 1: תמונות סטילס מהסרטון המציגות את הפרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד מוח עכבר ביום העברי E18.5, תוך שמירה על בלוטת האבנוס שלמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71934/71934fig1largev2.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="אנטומיית מוח של עכבר ביום העובר E18.5; חיבור בלוטת האצטרובל, תרשים חתך קורונלי, ביטוי Crx, DAPI/CRX." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71934/71934fig2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="איור 2"> 
איור 2תוצאות מייצגות. (A(דוגמאות מייצגות של שני מוחות עכברים בשלב E18.5 שבהם בלוטת האצטרובל ננתקה במהלך הליך הניתוח הסטנדרטי (שמאל), בהשוואה למוח שבו בלוטת האצטרובל נותרה שלמה תוך שימוש בשיטה המתוארת (ימין). (B( ) איור סכמטי של חיתוך קורונלי ביום E18.5 המראה את בלוטת האצטרובל בורוד. ( )כגון) במקום (In situ) היברידיזציה עבור Crx בשלבים E16.5 ו-E18.5, דבר המעיד על ביטוי ספציפי בבלוטת האצטרובל. (ד'(צביעה אימונוהיסטוכימית עבור CRX ביום העברי 18.5 (E18.5).ה) גרף עמודות המציג את שיעורי ההצלחה (בידוד המוח כאשר בלוטת האפיתופיזה שלמה) והכישלון (בלוטת האפיתופיזה פגומה או אבדה) של הפרוטוקול בשלבי התפתחות עובריים (E16.5 ו-E18.5) ופוסטנטליים (P0 ו-P7). סרגלי קנה מידה: 100 µmN = 6 חזרות ביולוגיות עבור A, C ו-D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71934/71934fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן אנו מציגים פרוטוקול נתיחה המשמר את בלוטת האצטרובל, שלעיתים קרובות אובדת בעת הוצאת המוח מהגולגולת. פרוטוקול זה מבטיח את שימורה של בלוטת האצטרובל בהכנות של מוח עכבר עוברי ובשלבים מוקדמים לאחר הלידה עבור יישומים המשכיים, הכוללים אימונוהיסטוכימיה, in situ hybridization וטרנסקריפטומיקה מרחבית.

הבלוטה האפיתליאלית (pineal gland), מבנה נוירואנדוקריני המפריש מלטונין, נוצרת מנבט (anlage) בקו האמצע הגבי של המוח הקדמי העוברי. בשלב עוברי...

preserving-the-pineal-gland-in-perinatal-mouse-brain-preparations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

הנורה עכבר חוש הריח אבזר (AOB) כבר קשה ללמוד בהקשר של קידוד חושי. הנה, אנחנו מדגימים נתיחה שמייצרת vivo הכנה לשעבר שבו נוירונים AOB יישארו תפקודי מחוברים לתשומות ההיקפית שלהם, ומקלים על מחקרים בתחום עיבוד מידע של פרומונים העכבר וkairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

תוך ניצול אסטרטגיה גנטית בינארית אנו מספקים פרוטוקול מפורט למעקב אחר מעגלים עצביים בעכברים המבטאים עוקבים טרנס-סינפטיים משלימים לאחר רקומבינציה בתיווך Cre. מכיוון שייצור עוקבים ספציפיים לתא מקודד גנטית, הגישה הניסיונית שלנו מתאימה לחקור את היווצרותם והתבגרותם של מעגלים עצביים במהלך התפתחות המוח העוברי של עכברים ברזולוציית תא בודד.

מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר טיהור של תא כלי הדם של מוח העכבר. כלי מוח מבודדים כוללים תאי אנדותל המקושרים בצמתים הדוקים ומוקפים בלמינה בסיסית רציפה, פריציטים, תאי שריר חלק בכלי הדם, כמו גם ממברנות אסטרוגליאליות סביב כלי הדם.

טיהור של כלי מוח עכבר

הקרנות על-עמוד השדרה חשובות לתפיסת כאב והתנהגויות אחרות, וסיבים סרוטונרגיים הם אחת ממערכות הסיבים הללו. המחקר הנוכחי התמקד ביישום הפרוטוקול המשולב CLARITY/CUBIC על חוט השדרה של העכבר על מנת לחקור את סיום הסיבים הסרוטונרגיים הללו.

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

פרוטוקול זה מתאר את הייצוב של רמת החמצן נפח קטן של מאגר ממוחזר, היבטים מתודולוגיים של הקלטה פלסטיות סינפטית תלויי-פעילות המשוקע פרוסות בהיפוקמפוס חריפה.

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

Coeruleus לוקוס יש מקבץ קטן של נוירונים מעורב במגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להתכונן חלקים במוח העכבר מחקרים של חלבונים, מתכות בגרעין הזה.

לוקליזציה של Coeruleus לוקוס במוח העכבר

Tata Institute of Fundamental Research.  Here we present a dissection protocol that preserves the pineal gland, which is often lost when the brain is removed from the cranial vault. This protocol ensures retention of the pineal gland in embryonic and early postnatal mouse brain preparations for downstream applications, including immunohistochemistry, in situ hybridization, and spatial transcriptomics.

שימור בלוטת האצטרובל בהכנות של מוח עכבר בתקופה הפרינטלית

גלה סרטונים נוספים