Name: ייצוב חלבון וחלבון—עיבוי RNA בהידרוגלים אגרוזיים בעלי התכה נמוכה למדידות ביופיזיקליות כמותיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-24T13:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
Description: למד פרוטוקול לייצוב קונדנסטים ביומולקולריים בהידרוג'לים אגרוזיים בעלי התכה נמוכה. השיטה שומרת על תכונות דינמיות ומאפשרת מדידות ביופיזיקליות כמותיות ממושכות בביופיזיקה וביוכימיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Alberti S. Phase separation in biology. Curr Biol. 2017;27(20):R1097-102.</li>
	<li>Rabouille C, Alberti S. Cell adaptation upon stress: the emerging role of membrane-less compartments. Curr Opin Cell Biol. 2017;47:34-42.</li>
	<li>Boeynaems S, et al. Protein phase separation: a new phase in cell biology. Trends Cell Biol. 2018;28(6):420-35.</li>
	<li>Hyman AA, Weber CA, J&#252;licher F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014;30:39-58.</li>
	<li>Banani SF, Lee HO, Hyman AA, Rosen MK. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017;18(5):285-98.</li>
	<li>Patel A, et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 2015;162(5):1066-77.</li>
	<li>Shen Y, et al. The liquid-to-solid transition of FUS is promoted by the condensate surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(33):e2301366120.</li>
	<li>Brocca S, Grandori R, Longhi S, Uversky V. Liquid-liquid phase separation by intrinsically disordered protein regions of viruses: roles in viral life cycle and control of virus-host interactions. Int J Mol Sci. 2020;21(23):9045.</li>
	<li>Scoca V, Di Nunzio F. Membraneless organelles restructured and built by pandemic viruses: HIV-1 and SARS-CoV-2. J Mol Cell Biol. 2021;13(4):259-68.</li>
	<li>Su J, Wilson M, Samuel C, Ma D. Formation and function of liquid-like viral factories in negative-sense single-stranded RNA virus infections. Viruses. 2021;13(1):126.</li>
	<li>Etibor TA, Yamauchi Y, Amorim MJ. Liquid biomolecular condensates and viral lifecycles: review and perspectives. Viruses. 2021;13(3):366.</li>
	<li>Guseva S, et al. Measles virus nucleo- and phosphoproteins form liquid-like phase-separated compartments that promote nucleocapsid assembly. Sci Adv. 2020;6(14):eaaz7095.</li>
	<li>Emmanouilidis L, et al. NMR and EPR reveal a compaction of the RNA-binding protein FUS upon droplet formation. Nat Chem Biol. 2021;17(5):608-14.</li>
	<li>Kathe NC, Novakovic M, Allain FHT. Buffer choice and pH strongly influence phase separation of SARS-CoV-2 nucleocapsid with RNA. Mol Biol Cell. 2024;35(5):ar73.</li>
	<li>Novakovic M, Schmoll J, Emmanouilidis L, Allain FHT. Using solution NMR to characterize biomolecular condensates under biphasic conditions. J Vis Exp. 2026;(230):e70530.</li>
	<li>Novakovic M, et al. LLPS REDIFINE allows the biophysical characterization of multicomponent condensates without tags or labels. Nat Commun. 2025;16(1):4628.</li>
	<li>Emmanouilidis L, et al. A solid beta-sheet structure is formed at the surface of FUS droplets during aging. Nat Chem Biol. 2024;20(8):1044-52.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>any brand is OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18-well chamber slides</td><td>ibidi</td><td>81816</td><td>for STORM</td></tr><tr><td>agarose, low gelling temperature</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>molecular biology grade</td></tr><tr><td>agarose, ultra pure&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>channel slides</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>for microscopy</td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dye, NHS chemistry</td><td>Jena Biosciences</td><td>FP-201-CY5</td><td>for labeling protein</td></tr><tr><td>D2O (deuterium oxide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>easyFRAP</td><td>Koulouras et al. 2018</td><td>N/A</td><td>https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/</td></tr><tr><td>Everspark 2.0 dSTORM buffer</td><td>idylle</td><td>KMO|ETE+</td><td></td></tr><tr><td>FUS NTD protein</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>expressed recombinantly in our lab, as described in ref 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>heating block or water bath</td><td>any brand is OK</td><td>N/A</td><td>any make or model will do</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>image analysis software</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NMR spectrometer</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>750 MHz, PATXI room-temperature probe, see ref 13 for more details (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>NMR tube</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>3 mm, glass</td></tr><tr><td>P10, P20, P200 and P1000 pipettes</td><td>any brand is OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pCp-Cy3-dye&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1706-CY3</td><td>for labelling RNA</td></tr><tr><td>poly(A) RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>in-house in vitro transcribed in our lab, length approx 50 nucleotides, as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>s2m RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>in-house in vitro transcribed in our lab, length 45 nucleotides, sequence: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 nucleocapsid protein</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>expressed recombinantly in our lab, as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>software for plotting (e.g. R)</td><td>R-Project</td><td>Version 4.2.1</td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>STORM microscope</td><td>Nikon N-STORM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ThunderSTORM plugin</td><td>Ovesny et al. 2014</td><td>N/A</td><td>https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/</td></tr><tr><td>tips for the used pipettes</td><td>any brand is OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin</td><td>Bruker</td><td>Version 3.2 and 4.1</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצוב חלבון וחלבון—עיבוי rna בהידרוג'לים אגרוזיים בעלי התכה נמוכה למדידות ביופיזיקליות כמותיות

Stabilizing Protein and Protein&#8212;RNA Condensates in Low-Melting Agarose Hydrogels for Quantitative Biophysical Measurements

ייצוב חלבון וחלבון—עיבוי RNA בהידרוג'לים אגרוזיים בעלי התכה נמוכה למדידות ביופיזיקליות כמותיות

Biomolecular condensates formed by liquid&#8211;liquid phase separation are increasingly recognized as fundamental organizational units of the cell, with ...

המחקר שלנו התמקד בפיתוח פרוטוקול סטנדרטי להטמעה באגרוז למטרת קיבוע של מעבשים ביו-מולקולריים בתלת-ממד, תוך שימור תכונותיהם הדינמיות. מעבשים נוטים לנוע, להתמזג זה עם זה או להיצמד למשטחים, דבר המקשה על ביצוע מדידות מסוימות. פרוטוקול ההטמעה באגרוז זה נותן מענה למגבלות אלו.כדי להתחיל, שקלו את הכמות המתאימה של אגרוז (agarose) רגיל או בעל נקודת התכה נמוכה והוסיפו אותה למבחנה של 1.5 מיליליטר המכילה droplet buffer. חממו את מלאי האגרוז ל-80 עד 90 °C בבלוק חימום או במקלח מים, והמיסו את האגרוז באופן מלא על ידי ערבוב ב-vortex למשך כ-10 דקות. הביאו את מלאי האגרוז לטמפרטורת שיווי משקל של 37 °C עבור אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה, או 55 °C עבור אגרוז רגיל, בבלוק החימום או במקלח המים. ודאו שהתמיסה נשארת צלולה ונוזלית בטמפרטורה זו. בדקו את טמפרטורת מלאי האגרוז באמצעות מדחום.חממו מראש את כל החומרים שיבואו במגע ישיר עם האגרוז לטמפרטורה של כ-37 מעלות צלזיוס על ידי הנחתם על בלוק חימום או באינקובטור למשך שתיים עד שלוש דקות. אספו את הריאגנטים הדרושים להכנת באפר הטיפות, רכיבי הפרדת הפאזות ותוספים נוספים עבור הדגימה. הביאו את כל התמיסות שהוכנו לשיווי משקל בטמפרטורת החדר. חשבו את הנפחים הדרושים של באפר הטיפות, מלאי האגרוז, רכיבי הפרדת הפאזות והתוספים המשלימים עבור הדגימה. כערכי התחלה, השתמשו בריכוז סופי של אגרוז של 0.3 עד 0.5% משקל לנפח עבור בדיקות ביופיזיות סטנדרטיות, ו-0.8 עד 1.0% משקל לנפח עבור ניסויי ייצוב לטווח ארוך. הוסיפו ראשית את הנפחים המחושבים של הבאפר והאגרוז, ולאחריהם את התוספים ורכיבי הפרדת הפאזות לתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר שחוממה מראש. השאירו את המבחנה בבלוק החימום או במקלחת המים, וערבבו את התערובת באמצעות פיפטה (pipette up and down) מספר פעמים, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר. העבירו במהירות את הדגימה לעל זכוכית המיקרוסקופ באמצעות פיפטה. המתינו שהדגימה תהפוך לג'ל בטמפרטורת החדר למשך 5 עד 10 דקות, ולאחר מכן מדדו את הדגימה בהתאם לפרוטוקול המיקרוסקופיה הסטנדרטי.טיפות שנוצרו עם N-protein ו-polyA בנוכחות 0.5% משקל לנפח של agarose במיסוך נמוך היו בערך באותו גודל כמו טיפות שנוצרו ללא agarose במיסוך נמוך לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר. 60 דקות לאחר הכנת הדגימה, טיפות המוטמעות ב-agarose לא שינו את גודלן, בעוד שקונדנסטים ללא agarose במיסוך נמוך הראו עלייה דרסטית בגודל עקב התמזגות והרטבת פני השטח. התאוששות פלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטוכימית (FRAP) ודיפוזיה נראית של הטיפות היו דומות מאוד, הן עם agarose במיסוך נמוך והן בלעדיו.פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לדגם וכמת טיפות לאורך פרקי זמן ארוכים תוך שימור התנהגותן הדינמית. האתגר הגדול ביותר בביצוע פרוטוקול זה הוא השגת הטמפרטורה הנכונה של האגרוז והתזמון המדויק של ההטמעה. לאחר ההטמעה, ניתן לחקור את המעבשים באמצעות מגוון רחב של טכניקות מיקרוסקופיה או שיטות ביופיזיות אחרות כגון NMR.

stabilizing-protein-proteinrna-condensates-low-melting-agarose

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניסיוני בטכניקות בשימוש לפברק תואם, תאי המטריצה ​​(ECM) מצעים מצופה מתאים תרבית תאים, ואשר ניתנים במיקרוסקופ כוח המתיחה והתבוננות ההשפעות של קשיחות ECM על התנהגות התא.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

בסרטון זה, אנו מדגימים את ההליך לקביעת פעילות הליקייס של חלבון מטרה כדי לשחרר את מצע dsRNA המסומן בביוטין. פעילות האנזים זוהתה על ידי ניתוח שינוי הניידות האלקטרופורטית, ואחריו בדיקת כימילומינסנציה באמצעות סטרפטווידין מצומד אנזים כימילומינסנטי.

מדידת פעילות מנחת מסוקים של חלבון מטרה באמצעות דופלקסים RNA המסומנים בביוטין

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

פרוטוקול מוצג לייצור tRNA (UUU) וניתוח של tRNA (UUU) במורכבות עם TDAA אנזים ידי מבחני ג 'ל agarose פיגור.

פרוטאין tRNA Agarose ג&#39;ל מבחני פיגור לניתוח של<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonylcarbamoyladenosine TCDA פונקציה

יליד polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה היא כלי בסיסי לניתוח אינטראקציות רנ"א חלבון. באופן מסורתי רוב הניסויים השתמשו בג'לים אנכיים. עם זאת, ג 'לים אופקית לספק מספר יתרונות, כגון הזדמנות לפקח מתחמי במהלך אלקטרופורזה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפקת ושימוש אופקי גלוקל אלקטרופורזה הילידים.

ג &#39;ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ&quot;א קומפלקסים

פולימרים semiflexible להציג תכונות מכניות ייחודי המוחלות בהרחבה על ידי מערכות החיים. עם זאת, מחקרים שיטתיים על biopolymers מוגבלות מאז מאפיינים כגון הפולימר קשיחות אינם נגישים. כתב יד זה מתאר איך מגבלה זו הוא מצויין לתכנות צינוריות דנ א, הפעלת ניסיוני מחקרים על ההשפעה של פילמנט קשיחות.

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

טכניקה חדשה של rheometry כוח-קלאמפ משמש כדי לחקור את התכונות המכאניות של דגימות בנפח נמוך חלבון מבוססת הידרוג קשורה בין מנוע סליל קול חיישן כוח. מערכת אנלוגית (PID) פרופורציונלי-אינטגרל-נגזרת מאפשר לבצע את 'חסימת העורקים' של הכוח מנוסים בפרוטוקול הרצוי.

. מלחציים צולבים כוח Rheometry על אפיון Hydrogels מבוססי חלבונים

הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

אנו מתארים את ההנדסה של פולימראז T7 RNA חדשני הקשור לדנ"א כדי לווסת את תגובות התמלול במבחנה. אנו דנים בצעדים לסינתזה ואפיון חלבונים, מאמתים רגולציה של תמלול הוכחת הרעיון, ודנים ביישומיה במחשוב מולקולרי, אבחון ועיבוד מידע מולקולרי.

RNA פולימראז קשור DNA לתכנות תמלול במבחנה וחישוב מולקולרי

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לשיטות NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) ו-CONdensate DEtectioN באמצעות העברת מגנטיזציה SEmi-מוצק (CONDENSE-MT) המאפשרים אפיון כמותי ללא תוויות של קונדנזטים ביומולקולריים בתנאים דו-פאזיים, החושפים חלוקה מולקולרית, דינמיקת חילופיים, הידרציה של קונדנסאט ומבנה טיפות ללא שקיעה או תיוג.

שימוש ב-NMR בתמיסה לאפיון קונדנסטים ביומולקולריים בתנאים דו-פאזיים

למד פרוטוקול לייצוב קונדנסטים ביומולקולריים בהידרוג'לים אגרוזיים בעלי התכה נמוכה. השיטה שומרת על תכונות דינמיות ומאפשרת מדידות ביופיזיקליות כמותיות ממושכות בביופיזיקה וביוכימיה.

ייצוב חלבון וחלבון—עיבוי RNA בהידרוג'לים אגרוזיים בעלי התכה נמוכה למדידות ביופיזיקליות כמותיות

גלה סרטונים נוספים