ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
	<li>Alberti S. Phase separation in biology. Curr Biol. 2017;27(20):R1097-102.</li>
	<li>Rabouille C, Alberti S. Cell adaptation upon stress: the emerging role of membrane-less compartments. Curr Opin Cell Biol. 2017;47:34-42.</li>
	<li>Boeynaems S, et al. Protein phase separation: a new phase in cell biology. Trends Cell Biol. 2018;28(6):420-35.</li>
	<li>Hyman AA, Weber CA, J&#252;licher F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014;30:39-58.</li>
	<li>Banani SF, Lee HO, Hyman AA, Rosen MK. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017;18(5):285-98.</li>
	<li>Patel A, et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 2015;162(5):1066-77.</li>
	<li>Shen Y, et al. The liquid-to-solid transition of FUS is promoted by the condensate surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(33):e2301366120.</li>
	<li>Brocca S, Grandori R, Longhi S, Uversky V. Liquid-liquid phase separation by intrinsically disordered protein regions of viruses: roles in viral life cycle and control of virus-host interactions. Int J Mol Sci. 2020;21(23):9045.</li>
	<li>Scoca V, Di Nunzio F. Membraneless organelles restructured and built by pandemic viruses: HIV-1 and SARS-CoV-2. J Mol Cell Biol. 2021;13(4):259-68.</li>
	<li>Su J, Wilson M, Samuel C, Ma D. Formation and function of liquid-like viral factories in negative-sense single-stranded RNA virus infections. Viruses. 2021;13(1):126.</li>
	<li>Etibor TA, Yamauchi Y, Amorim MJ. Liquid biomolecular condensates and viral lifecycles: review and perspectives. Viruses. 2021;13(3):366.</li>
	<li>Guseva S, et al. Measles virus nucleo- and phosphoproteins form liquid-like phase-separated compartments that promote nucleocapsid assembly. Sci Adv. 2020;6(14):eaaz7095.</li>
	<li>Emmanouilidis L, et al. NMR and EPR reveal a compaction of the RNA-binding protein FUS upon droplet formation. Nat Chem Biol. 2021;17(5):608-14.</li>
	<li>Kathe NC, Novakovic M, Allain FHT. Buffer choice and pH strongly influence phase separation of SARS-CoV-2 nucleocapsid with RNA. Mol Biol Cell. 2024;35(5):ar73.</li>
	<li>Novakovic M, Schmoll J, Emmanouilidis L, Allain FHT. Using solution NMR to characterize biomolecular condensates under biphasic conditions. J Vis Exp. 2026;(230):e70530.</li>
	<li>Novakovic M, et al. LLPS REDIFINE allows the biophysical characterization of multicomponent condensates without tags or labels. Nat Commun. 2025;16(1):4628.</li>
	<li>Emmanouilidis L, et al. A solid beta-sheet structure is formed at the surface of FUS droplets during aging. Nat Chem Biol. 2024;20(8):1044-52.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>any brand is OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18-well chamber slides</td><td>ibidi</td><td>81816</td><td>for STORM</td></tr><tr><td>agarose, low gelling temperature</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>molecular biology grade</td></tr><tr><td>agarose, ultra pure&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>channel slides</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>for microscopy</td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dye, NHS chemistry</td><td>Jena Biosciences</td><td>FP-201-CY5</td><td>for labeling protein</td></tr><tr><td>D2O (deuterium oxide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>easyFRAP</td><td>Koulouras et al. 2018</td><td>N/A</td><td>https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/</td></tr><tr><td>Everspark 2.0 dSTORM buffer</td><td>idylle</td><td>KMO|ETE+</td><td></td></tr><tr><td>FUS NTD protein</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>expressed recombinantly in our lab, as described in ref 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>heating block or water bath</td><td>any brand is OK</td><td>N/A</td><td>any make or model will do</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>image analysis software</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NMR spectrometer</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>750 MHz, PATXI room-temperature probe, see ref 13 for more details (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>NMR tube</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>3 mm, glass</td></tr><tr><td>P10, P20, P200 and P1000 pipettes</td><td>any brand is OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pCp-Cy3-dye&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1706-CY3</td><td>for labelling RNA</td></tr><tr><td>poly(A) RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>in-house in vitro transcribed in our lab, length approx 50 nucleotides, as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>s2m RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>in-house in vitro transcribed in our lab, length 45 nucleotides, sequence: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 nucleocapsid protein</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>expressed recombinantly in our lab, as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>software for plotting (e.g. R)</td><td>R-Project</td><td>Version 4.2.1</td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>STORM microscope</td><td>Nikon N-STORM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ThunderSTORM plugin</td><td>Ovesny et al. 2014</td><td>N/A</td><td>https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/</td></tr><tr><td>tips for the used pipettes</td><td>any brand is OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin</td><td>Bruker</td><td>Version 3.2 and 4.1</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצוב חלבון וחלבון—עיבוי rna בהידרוג'לים אגרוזיים בעלי התכה נמוכה למדידות ביופיזיקליות כמותיות

Stabilizing Protein and Protein&#8212;RNA Condensates in Low-Melting Agarose Hydrogels for Quantitative Biophysical Measurements

ייצוב חלבון וחלבון—עיבוי RNA בהידרוג'לים אגרוזיים בעלי התכה נמוכה למדידות ביופיזיקליות כמותיות

Biomolecular condensates formed by liquid&#8211;liquid phase separation are increasingly recognized as fundamental organizational units of the cell, with ...

מחקרנו התמקד בפיתוח פרוטוקול סטנדרטי להטמעה באגרוזה להבטחת קיבוע של קונדנסאטים ביומולקולריים בתלת-ממד תוך שימור תכונותיהם הדינמיות. קונדנסאטים נוטים לנוע, להתמזג או להיצמד למשטחים, דבר המקשה על מדידות מסוימות. פרוטוקול ההטמעה באגרוזה זה נותן מענה למגבלות אלו.ראשית, שקלו את הכמות המתאימה של אגרוז בעל נקודת המסחה נמוכה או אגרוז רגיל והוסיפו אותה למבחנה של 1.5 milliliters המכילה droplet buffer. חממו את מלאי האגרוז ל-80 עד 90 °C בבלוק חימום או במקלח, והמיסו את האגרוז לחלוטין באמצעות ערבוב ב-vortex למשך כ-10 דקות. השאיגו איזון של מלאי האגרוז ל-37 °C עבור אגרוז בעל נקודת מסחה נמוכה, או ל-55 °C עבור אגרוז רגיל, בבלוק החימום או במקלח.ודאו שהתמיסה נותרת צלולה ונוזלית בטמפרטורה זו. בדקו את טמפרטורת מלאי האגרוז באמצעות מדחום. חממו מראש את כל החומרים שיבואו במגע ישיר עם האגרוז לטמפרטורה של כ-37 degrees Celsius, על ידי הנחתם על בלוק חימום או בתוך אינקובטור למשך שתי עד שלוש דקות.אסף את הריאגנטים הדרושים להכנת באפר הטיפות (droplet buffer), רכיבי הפרדת הפאזות ותוספים נוספים עבור הדגימות. הבא את כל התמיסות שהוכנו לטמפרטורת החדר. חשב את הנפחים הדרושים של באפר הטיפות, מלאי האגרוז, רכיבי הפרדת הפאזות והתוספים הנלווים עבור הדגימה.כרכיבי התחלה, השתמשו בריכוז אגרוז סופי של 0.3 עד 0.5% weight per volume עבור בדיקות ביופיזיות סטנדרטיות, ו-0.8 עד 1.0% weight per volume עבור ניסויי ייצוב לטווח ארוך. הוסיפו תחילה את הנפחים המחושבים של הבאפר והאגרוז, ולאחר מכן תוספים ומרכיבים להפרדת פאזות לתוך מבחנה בנפח 1.5 milliliter שחוממה מראש.השאירו את המבחנה בבלוק החימום או במקלח מים ושאבו את התערובת פנימה והחוצה עם פיפט מספר פעמים, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר. באמצעות פיפט, העבירו במהירות את הדגימה על גבי זכוכית למסמך מיקרוסקופי. אפשרו לדגימה להתגבש בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות, ולאחר מכן מדדו את הדגימה בהתאם לפרוטוקול המיקרוסקופיה הסטנדרטי.טיפות שנוצרו עם חלבון N ו-poly-A בנוכחות 0.5% משקל לנפח של אגרוז במיסון נמוך היו בערך באותו גודל של טיפות שנוצרו ללא אגרוז במיסון נמוך לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר. 60 דקות לאחר הכנת הדגימה, טיפות המוטמעות באגרוז לא שינו את גודלן, בעוד שקונדנסטים ללא אגרוז במיסון נמוך הראו עלייה דרסטית בגודל עקב התמזגות והרטבה של פני השטח. ההתאוששות של פלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטוכימית (FRAP) והדיפוזיה הנראית של הטיפות היו דומות מאוד עם אגרוז במיסון נמוך ולבלי אגרוז במיסון נמוך.פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לדגם וכמות טיפות לאורך פרקי זמן ארוכים תוך שימור התנהגותן הדינמית. האתגר הגדול ביותר בביצוע פרוטוקול זה הוא הגעה לטמפרטורה הנכונה של האגרוז ודיוק בתזמון ההטמעה. לאחר ההטמעה, ניתן לחקור את המעבשים באמצעות מגוון רחב של טכניקות מיקרוסקופיה או שיטות ביופיזיקליות אחרות, כגון NMR.

stabilizing-protein-proteinrna-condensates-low-melting-agarose

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניסיוני בטכניקות בשימוש לפברק תואם, תאי המטריצה ​​(ECM) מצעים מצופה מתאים תרבית תאים, ואשר ניתנים במיקרוסקופ כוח המתיחה והתבוננות ההשפעות של קשיחות ECM על התנהגות התא.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

סרטון זה מדגים את ההפרדה הדו-ממדית המבוססת על אלקטרופורזה של סיבי עמילואיד, ג'ל אגרוז. הטכניקה מפרידה את צברי העמילואיד הפולימורפיים בהתבסס על גודלם ההטרוגני.

אלקטרופורזה דו-ממדית למחצה של ג'ל אגרוז: טכניקה להפרדת סיבי עמילואידים פולימורפיים בהתבסס על הטרוגניות הגודל

בסרטון זה אנו מדגימים שיטת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל המפרידה חלבונים בודדים מתערובת חלבונים מורכבת המתקבלת מרקמות גידוליות של אדנומת יותרת המוח האנושית הלא תפקודית (NFPA). החלבונים מופרדים על בסיס המטען החשמלי שלהם בממד הראשון ובהמשך מופרדים על בסיס משקלים מולקולריים בממד השני.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

טכניקות מסורתיות לבודת ג'ל polyacrylamide (PA) המכיל בדיקות ניאון כרוכות הרבדה ג'ל בין משטח חסיד ושקופיות זכוכית. כאן, אנו מראים כי ציפוי שקופית זו עם פולי-D-ליזין (PDL) ובדיקות ניאון מתאים את הבדיקות לבתוך 1.6 מיקרומטר ממשטח ג'ל.

שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח

פרוטוקול מוצג לייצור tRNA (UUU) וניתוח של tRNA (UUU) במורכבות עם TDAA אנזים ידי מבחני ג 'ל agarose פיגור.

פרוטאין tRNA Agarose ג&#39;ל מבחני פיגור לניתוח של<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonylcarbamoyladenosine TCDA פונקציה

טכניקה חדשה של rheometry כוח-קלאמפ משמש כדי לחקור את התכונות המכאניות של דגימות בנפח נמוך חלבון מבוססת הידרוג קשורה בין מנוע סליל קול חיישן כוח. מערכת אנלוגית (PID) פרופורציונלי-אינטגרל-נגזרת מאפשר לבצע את 'חסימת העורקים' של הכוח מנוסים בפרוטוקול הרצוי.

. מלחציים צולבים כוח Rheometry על אפיון Hydrogels מבוססי חלבונים

פרוטוקול מוצג כדי לבדוק במהירות את יציבות תרמית של חלבונים במגוון תנאי באמצעות shift תרמי מבחני וננו דיפרנציאלית סריקה fluorimetry. הכוללת שלושה ייחודי יציבות מסכי, הם לבדיקה מאגר מערכות, מלחים, תוספים, יחד עם חלבונים כדי לזהות מאגרים מתאימים עבור לימודי המבנית תפקודית.

איך לייצב את חלבון: מסכי יציבות תרמית משמרת מבחני ו ננו דיפרנציאלית סריקה Fluorimetry בפרוייקט וירוס-X

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לשיטות NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) ו-CONdensate DEtectioN באמצעות העברת מגנטיזציה SEmi-מוצק (CONDENSE-MT) המאפשרים אפיון כמותי ללא תוויות של קונדנזטים ביומולקולריים בתנאים דו-פאזיים, החושפים חלוקה מולקולרית, דינמיקת חילופיים, הידרציה של קונדנסאט ומבנה טיפות ללא שקיעה או תיוג.

שימוש ב-NMR בתמיסה לאפיון קונדנסטים ביומולקולריים בתנאים דו-פאזיים

למרות שנוקשות המטריקס החוץ-תאית (ECM) היא רגולטור מרכזי להתנהגות התא, מנגנוני החישה והטרנסדוקציה הבסיסיים נותרו לא ברורים. כדי להתמודד עם זה, אנו מספקים פרוטוקולים ליצירת סובסטרטים מבוססי פוליאקרילאמיד וסיליקון עם קשיחות מכוונת, כדי לקדם את הבנתנו את הקשר בין תא ל-ECM.

יצירת תת-מטריצות חוץ-תאיות פוליאקרילאמיד וסיליקון עם קשיחות מוגדרת ליישומים בביולוגיה תאית

ETH Zürich.  כאן אנו מציגים שיטה חזקה לשיתוק פיזי של עיבוי נוזל-נוזל מופרד בפאזה בתוך מטריצת אגרוז הידרוג'ל נקבובית ובעלת התכה נמוכה, מבלי להפריע לדינמיקת הנוזל הפנימית שלהם. הגישה ממזערת את השקיעת טיפות, התלכדות וארטיפקטים של הרטבת משטחים, ומאפשרת הדמיה ש...

ייצוב חלבון וחלבון—עיבוי RNA בהידרוג'לים אגרוזיים בעלי התכה נמוכה למדידות ביופיזיקליות כמותיות

גלה סרטונים נוספים