Name: מדידת תיקון שברים דו-גדיליים ב-DNA באמצעות בדיקת DR-white ב-Drosophila melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: למד את שיטת DR-white למדידת תיקון שברים דו-גדיליים ב-DNA ב-Drosophila melanogaster. פרוטוקול זה מאפשר חקירת מנגנוני תיקון ביצורים רב-תאיים והבחנה בין נתיבי HR, NHEJ ו-SSA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

שיטה זו פותחה בעוד J.R.L. היה מקבל מענק מחקר של AFAR מה-American Federation for Aging Research.&#160;עבודה זו נתמכה גם על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (1R15GM110454 ו-1R15GM129628) עבור J.R.L. האיורים פותחו בסיוע של BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

<ol>
	<li>Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.</li>
	<li>Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.</li>
	<li>Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.</li>
	<li>Figueroa-Gonz&#225;lez G, P&#233;rez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.</li>
	<li>Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.</li>
	<li>Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.</li>
	<li>Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.</li>
	<li>Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.</li>
	<li>Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.</li>
	<li>Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.</li>
	<li>Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.</li>
	<li>Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.</li>
	<li>Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.</li>
	<li>Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.</li>
	<li>Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.</li>
	<li>Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.</li>
	<li>Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.</li>
	<li>Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.</li>
	<li>McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.</li>
	<li>Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.</li>
	<li>Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.</li>
	<li>Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.</li>
	<li>Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.</li>
	<li>Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.</li>
	<li>Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.</li>
	<li>Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.</li>
	<li>Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.</li>
	<li>Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.</li>
	<li>Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים כספיים או שאינם כספיים להצהיר עליהם.

הורסטיליות של מערכת ה-DR-white היא גורם קריטי התורם להשפעתה בעבר ובעתיד בתחום תיקון ה-DNA. ראשית, רצף האינטגרציה attB בתוך מבנה הדיווח (reporter construct) של DR-white מאפשר לחוקרים להכווין את הדיווח למספר מיקומים בתוך הגנום של Drosophila21, כאשר מספר קווים מכוונים כבר זמינים22. שנית, הזמינות של טרנס-גנים שונים של I-SceI, כגון ביטוי תלוי הלם תרמי באמצעות מקדם hsp70 (מחקר זה), ביטוי קונסטיטוטיבי באמצעות מקדם ubiquitin23, וביטוי בקו הנבט לפני המיוזה באמצעות מקדם Bam24, מספקת הקשרים התפתחותיים ורקמתיים ספציפיים רבים לבחינת תיקון DSB. ללא קשר לטרנס-גן של &#160;I-SceI שבו נעשה שימוש, יש לתכנן את ההכלאות הגנטיות בזהירות כדי להבטיח שהטרנס-גן של I-SceI יוכנס רק בהכלאה הסופית כדי להבטיח השראה נכונה של DSB. חשוב לציין שתדירויות התיקון עשויות להשתנות באופן משמעותי בהתאם למיקום הגנומי של DR-white ו/או לטרנס-גן של I-SceI&#160;שבו נעשה שימוש. ניסויים עתידיים יוכלו להשוות עוד יותר בין מיקומים גנומיים ובין טרנס-גנים של I-SceI כדי לקבוע האם ההקשר הגנומי או הספציפיות הרקמתית הם המניעים את תיקון ה-DSB.
יתרון מסוים של בדיקת ה-DR-white ונגזרותיה הוא היכולת שלהן לזהות תיקון של DSBs באמצעות רקומינציה הומולוגית, NHEJ עם עיבוד, ובמרבית המקרים, SSA. למרות שהמערכת תוכננה לזיהוי פנוטיפי של אירועי תיקון בתאי נבט, היא מאפשרת גם ניתוח של רקמות סומטיות באמצעות ניתוח אלגוריתמי של TIDE. למרות יתרונות אלו, ישנן מספר מגבלות של בדיקה זו שיש לקחת בחשבון. ראוי לציין כי בדיקת ה-DR-white עלולה להמעיט בערכם של שיעורי ה-HR. כפי שקורה בבדיקות דגישן גנטיות אחרות המשתמשות ב-DSBs המושרים על ידי נוקליאז, תיקון באמצעות HR מכרומטידה אחות (intersister HR) אינו ניתן להבחנה מאירוע ללא DSB או מ-NHEJ ללא עיבוד. לכן, לפחות חלק מהמחלקה של No DSB/NHEJ עשויים להיות אירועי HR. בהתחשב במגבלה זו, יש לנהוג בזהירות בתוצאות המשוות גורמים גנטיים (כגון שורות מוטנטיות). מגבלות נוספות של הבדיקה כוללות חוסר יכולת להעריך אירועים פרה-מיוטיים שלא הניבו צאצאים בריאים. לדוגמה, אירועי DSB שייתכן ולא תוקנו והובילו למות התא לא ייספרו בצאצאים. בעוד שפוריות כללית עשויה להוות מדד איכותני למות תאי נבט, ייתכן שיהיה צורך בבדיקות מבוססות תאים (כגון TUNEL). בנוסף, ניתוח סקריפט ה-TIDE מספק רק את הפרופורציה של אירועים ניתנים לגילוי באוכלוסיית תאים. כדי לקבוע תוצאות רצף ספציפיות של indel, נדרש ריצוף של אירועי תיקון בודדים באמצעות ריצוף DNA מולטיפלקס.
בדיקת ה-DR-white כבר השפיעה עמוקות על חקר תיקון DSB. יישומה זיהה גורמים התורמים לתיקון DSB באורגניזמים רב-תאיים, כולל גיל25, מין26, מיקום ה-DSB22,26, מיקום רצף התורם15, מחזור התא וסוג הרקמה26. בנוסף, השתמשנו בבדיקה כדי לזהות מספר חלבונים המניעים גם הם את בחירת נתיב התיקון ו/או תיקון של רצפים מורחקים ב-Drosophila, כולל Msh627, Blm28, Rif116, ו-CtIP16,29. ואכן, השימוש המבוסס ב-Drosophila כאורגניזם מודל גנטי עם חלבוני תיקון DNA שמורים מספק מערכת רב-תאית פשוטה לחקר הגורמים הגנטיים, התאיים והאורגניזמיים התורמים לתיקון DSB בהקשרים ביולוגיים מורכבים.

השלמות הגנומית מאוימת תכוף על ידי נגעים ב-DNA, שביניהם שברים של שני הגדילים (DSBs) הם רעילים במיוחד. אם שברים אלה אינם מתוקנים, הם עלולים להוביל לאובדן גנטי, לארגון מחדש של כרומוזומים ולמוות של תאים1. לכן, תאים פיתחו מסלולים מרובים לתיקון DSBs. חיבור קצוות לא הומולוגי (NHEJ) מחבר ישירות את שני הקצוות של ה-DSB, מה שעלול להוביל להכנסת indels באתר השבר; חיבור גדיל בודד&#160;(SSA) מנצל רצפים משלימים המקיפים את אתר השבר לצורך תיקון, מה שגורם למחיקות באתר השבר; בעוד שרקומבינציה הומולוגית (HR) משתמשת ברצף הומולוגי כתבנית לתיקון2,3.
היסטורית, מחקרים של תיקון DSB היו מוגבלים לבדיקות ביוכימיות4 או למערכות של תא בודד, כגון חיידקים5,6, שמרים7,8, ותרביות תאי יונקים9,10. בעוד שמודלים אלו היו מכריעים בזיהוי חלבוני תיקון מרכזיים ומנגנוניהם, הם חסרים את המורכבות הביולוגית של אורגניזם רב-תאי. Drosophila melanogaster הפכה למודל רב-תאי פופולרי לחקר תיקון DNA. עם זאת, בדיקות רבות כיום מותאמות למסלולי תיקון ספציפיים11; משתמשות בסטיות כרומוזומליות גדולות, כגון חיתוך P-element12; או דורשות ניתוחים מולקולריים הגוזלים זמן רב13. בדיקת ה-DR-white נותנת מענה לאתגרים אלו על ידי אספקת רפורטר גנטי פשוט לתיקון DNA ב-Drosophila14. מחקר זה מספק סבב עבודה מלא, מעשי ומפורט שלב אחר שלב לביצוע בדיקות גנטיות ומולקולריות למדידת תיקון DNA DSB באמצעות בדיקת ה-DR-white המוכרת.
הבדיקה משתמשת בשני חזרות ישירות של ה- דרזופילה לבן (והגן, המקנה את צבע העין האדום של סוג הבר (wild-type) (איור 1). שני העותקים אינם תפקודיים: הראשון, Sce.whiteמכיל השבלה הנושאת את רצף הזיהוי של המגנוקליאז I-SceI באתר SacI מסוג בר (wild-type) ומחדירה קודון עצירה מוקדם; השני, לבן, קטוע הן בקצה '5 והן בקצה '3 ומשמש כתבנית לתיכון באמצעות רקומבינציה הומולוגית (HR). A דרוזופילה צהוב טרנסגן (י+), המקנה את צבע הגוף החום של סוג הבר (wild-type), נמצא בין השניים לבן חזרות. מאחר ש-DR-לבן הקסטה משולבת בתוך נראה שהטקסט שהזנת אינו מכיל תוכן לתרגום. אנא ספק את הטקסט המדעי באנגלית שברצונך לתרגם לעברית. רקע מוטנטי, DR-לבן הזבובים הם בעלי פנוטיפ של גוף חום מסוג בר ועיניים לבנות מוטנטיות.
ניתן להשרות DSBs ב-Sce.white על ידי הכלאת זבובים מסוג DR-white עם זבובים הנושאים טרנסגן I-SceI. ניתן למדוד תיקון של DSBs בקו הנבט הפרה-מיוטי על ידי דירוג צאצאים של הכלאת בדיקה. תיקון על ידי NHEJ מוביל לפנוטיפ ההורי של גוף חום ועיניים לבנות (איור 1A), בעוד שתיקון על ידי HR משחזר את רצף ה-white של הטיפוס הפראי ומוביל לצאצאים בעלי גוף חום ועיניים אדומות (איור 1B). תיקון SSA של ה-DSB או קרוס-אובר מיטוטי מובילים לאובדן של טרנסגן ה-yellow המתווך, מה שגורם לזבובים בעלי גוף צהוב ועיניים לבנות (איור 1C). כדי לנתח את תוצאות התיקון בתאים סומטיים, התאמנו את אלגוריתם ה-Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) לזיהוי NHEJ עם עיבוד ותיקון HR באופן ספציפי בבדיקת DR-white 15,16.
בדיקת ה-DR-white מציעה מספר יתרונות על פני בדיקות תיקון DNA שבוססו בעבר ב-Drosophila. מכיוון שהשברים נוצרים ומתוקנים בקו הנבט, ניתן לזהות את תוצאות התיקון בקלות באמצעות אנליזה פנוטיפית. במקביל, הבדיקה היא ורסטילית ביותר. בעוד שהבדיקה תוכננה בעיקר למדידת תיקון מסוג HR, היא יכולה לזהות את שלושת נתיבי התיקון. פיתחנו בנוסף שתי תבניות תיקון פונקציונליות נוספות (איור 2). תבנית ה-iwhite.mu מכילה 28 פולימורפיזמים של נוקלאיד בודד (SNPs) שקטים ויוצרת צאצאים בעלי עיניים אדומות (איור 2A), מה שמקל על מחקרים של אורכי מקטעי המרת גנים (GCT) ותיקון HR בין רצפים מובחנים14.&#160;תבנית ה-iwhiteΔ9 מכילה מחיקה של תשעה זוגות בסיסים באתר SacI מסוג wild-type וגורמת לצאצאים בעלי עיניים כתומות (איור 2B). תכונה זו מאפשרת לחוקרים לעקוב אחר תיקון HR מתבניות נפרדות, תכונה הייחודית לבדיקת ה-DR-white15.

<table><tbody><tr><td>עלי פסטל (pestles) בנפח 0.5 מ"ל, נקיים מ-RNAse/DNAse</td><td>Fisher Scientific</td><td>12141363</td><td>להומוגניזציה של דגימות לצורך מיצוי gDNA</td></tr><tr><td>כדורי צמר גפן</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>לגידול סטנדרטי של Drosophila</td></tr><tr><td>אינקובטור מקורר בפלטייר ל-Drosophila</td><td>מעבדת של (Shel Lab)</td><td>SRI6PF</td><td>לגידול סטנדרטי של Drosophila</td></tr><tr><td>מבטי דרוזופילה (Drosophila stock): y[1] w[1]</td><td>בלומינגטון דרוסופיליה&amp;nbsp; מרכז מאגרים</td><td>RRID:BDSC 1495</td><td></td></tr><tr><td>מלאי Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+}&amp;nbsp;</td><td>מעבדת LaRocque</td><td>לא רלוונטי</td><td>נוצר על ידי מעבדת LaRocque באמצעות רקומבינציה סטנדרטית של זן המקור RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) ממרכז זני הדרוזופילה של Bloomington; זמין לבקשה מהמחבר המקשר</td></tr><tr><td>מטבלת זבובים של Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>מעבדת LaRocque</td><td>לא רלוונטי</td><td>בדיקת DR-white המשולבת במאגר RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); זמין לפי בקשה מהמחבר המקשר</td></tr><tr><td>מערך זבובים (Drosophila stock): y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>מעבדת LaRocque</td><td>לא רלוונטי</td><td>בדיקת DR-white.mu ששולבה במאגר RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); זמין לבקשה מהמחבר המקשר</td></tr><tr><td>מבטי דרוסופילה (Drosophila stock): y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]</td><td>מעבדת LaRocque</td><td>לא רלוונטי</td><td>לבן&amp;Delta;9 תורמים שולבו במאגר RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); זמין לפי בקשה מהמחבר המקשר</td></tr><tr><td>פקקי בקבוקי דרוסופילה של Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-100</td><td>לגידול סטנדרטי של Drosophila</td></tr><tr><td>סטראומיקרוסקופ פלואורסצנטי (RFP)</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1-FL</td><td>עבור Drosophila סטנדרטית &quot;דחיפת זבובים&quot; ומיון על בסיס פלואורסצנציה</td></tr><tr><td>משטח גידול לזבובים Drosophila של FlyStuff</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td>עבור Drosophila סטנדרטית &quot;דחיפת זבובים&quot;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים MyBath 4L</td><td>Midwest Scientific</td><td>MB-2000-4</td><td>עבור&amp;nbsp; הלם תרמי</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518LY</td><td>לכימות DNA</td></tr><tr><td>מצע גידול Nutri-fly Bloomington</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>לגידול סטנדרטי של Drosophila</td></tr><tr><td>הומוגנייזר מנועי אלחוטי עם עלי ופסטל (Pellet Pestle)</td><td>DWK Life Sciences</td><td>K749540-0000</td><td>להומוגניזציה של דגימות לצורך מיצוי gDNA</td></tr><tr><td>בקבוקי פוליפרופילן</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>לגידול סטנדרטי של Drosophila</td></tr><tr><td>מבחנות פוליסטירן</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td>לגידול סטנדרטי של Drosophila, כולל הלם תרמי</td></tr><tr><td>פריימר/אוליגונוקלאוטיד DR-white_8f</td><td>לא רלוונטי; כל שירות סינתזה של אוליגונוקלאוטידים יהיה מספיק</td><td>לא רלוונטי</td><td>5'GTGGATCAGGTGATCCAGG</td></tr><tr><td>פריימר/אוליגונוקלאוטיד DR-white_8a</td><td>לא רלוונטי; כל שירות לסנתזה של אוליגוניוקלאוטידים הוא מספיק</td><td>לא רלוונטי</td><td>5&amp;rsquo;-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC</td></tr><tr><td>פריימר/אוליגונוקלאוטיד DR-white_9f</td><td>לא רלוונטי; כל שירות סינתזה של אוליגנוקלאוטידים הוא מספק</td><td>לא רלוונטי</td><td>5&amp;rsquo;-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC</td></tr><tr><td>R Studio</td><td>הנח</td><td>גרסה 2023.06.1+524</td><td>גרסה להורדה חינם; כל גרסה של R Studio היא מקובלת, אם כי הנתונים המוצגים נותחו באמצעות&amp;nbsp; גרסה 2023.06.1+524</td></tr><tr><td>חבילות R Studio: Biostrings</td><td>Bioconductor.org (גרסה 3.24)</td><td>גרסה 2.76.0</td><td>סקריפט R יבקש מהמשתמש להתקין חבילה זו</td></tr><tr><td>חבילות R Studio: sangerseqR</td><td>Bioconductor.org (גרסה 3.24)</td><td>גרסה 1.44.0</td><td>סקריפט ה-R יבקש מהמשתמש להתקין חבילה זו</td></tr><tr><td>SapphireAMP Fast PCR</td><td>Takara</td><td>RR350B</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>עבור Drosophila סטנדרטית &quot;דחיפת זבובים&quot;</td></tr><tr><td>ניקוי ג'ל ו-PCR באמצעות Wizard SV&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת תיקון שברים דו-גדיליים ב-dna באמצעות בדיקת dr-white ב-drosophila melanogaster

Measuring DNA Double-Strand Break Repair Using the DR-white Assay in Drosophila melanogaster

מחקרים מסורתיים בתיקון שברים דו-גדיליים (DSB) של DNA מוגבלים לעיתים קרובות לחקירות ביוכימיות או למערכות חד-תאיות (למשל, תאים, שמרים). כדי להקל על מחקרים של תיקון DSB באורגניזם רב-תאי, אנו משתמשים בבדיקת ה-DR-white ב-Drosophila melanogaster. בדיקת ה-DR-white היא בדיקת דגמי-דיווח (reporter assay) פשוטה אך ורסטילית לתיקון DSB, הנושאת רצף זיהוי יחיד של I-SceI, שניתן לחתוך על ידי ביטוי של המגנוקלאז I-SceI. ניתן להשרות ביטוי של I-SceI באופן קוסטטיבי, באמצעות הלם תרמי, או תחת פרומוטורים אחרים, מה שמאפשר חקירה של תיקון ספציפי לרקמה או לשלב התפתחותי. יתרון מרכזי של הבדיקה הוא שהיא יכולה להבחין בין תוצאות תיקון הכוללות רקומבינציה הומולוגית (HR), חיבור קצוות לא הומולוגי (NHEJ) וחיבור גדיל יחיד (SSA). מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לבדיקת ה-DR-white המבוססת, כולל תהליך עבודה שלב-אחר-שלב להשראת DSBs בקו הנבט הפרה-מיוטי וניתוח תופעתי של אירועי התיקון על ידי דירוג צאצאים. הוא מתאר גם ניתוח מולקולרי של אירועי תיקון באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ריצוף, וסקריפט R של Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). פרוטוקול זה מספק כלי שימושי לחקירת המנגנונים הגנטיים והמולקולריים של תיקון DNA במודל אורגניזמי.

Drosophila דרישה ל-Rad51 לצורך תיקון באמצעות רקומבינציה הומולוגית
ניסויי קו הנבט מוצלחים מניבים את המחלקות הפנוטיפיות הצפויות המוצגות ב-איור 3A ולפחות 20 צאצאים שניתן לדיגום לכל מבחנה. פנוטיפים בלתי צפויים או פחות מ-20 צאצאים שניתן לדיגום מעידים על זיהום או על פריון לא מספיק, ויש להסירם כפי שפורט בשלב 1.4.3. עבור אנליזת TIDE, דגימות מוצלחות מניבות אמפליקון באורך של כ-1.7 kb וכרומטוגרמות עם רקע נמוך לפני אתר השבירה; DNA בעל תפוקה נמוכה או מזוהם, וכרומטוגרמות עם רעש, הם תתי-אופטימליים ואינם ראויים לאנליזה.
בשימוש במבחן DR-white עם מקור I-SceI המושרה על ידי הלם תרמי, שכיחות תיקון ה-HR בזבובים מסוג בר (wild-type) היא 38.5 ± 1.2% (ממוצע ± SEM), בעוד ש-SSA מתרחש בכ-3.2 ± 0.35% (איור 3B&#160; ו-קובץ משלים 4). Rad51 (המקודד על ידי ההומולוג spnA ב-Drosophila) נחוץ לשלב פלישת הגדיל של רקומבינציה הומולוגית14,19. לפיכך, אובדן של Rad51 אמור להוביל ל-HR לא יעיל. ואכן, ברקע של DmRad51-/-, תיקון ה-HR פוחת ל-1.3 ± 0.4%, עם עלייה נלווית בתיקון SSA (34.5 ± 1.8%; איור 3B&#160; ו-קובץ משלים 4)14. סביר להניח כי הדבר נובע מאירועי תיקון שהיו אמורים לעבור רקומבינציה הומולוגית, אך תוקנו באופן חלופי על ידיי annealing של גדיל בודד של רצפי החזרות של white.
Drosophila תרומת CtIP לתיקון HR יעיל ברקמות סומטיות
אלגוריתם ה-TIDE מאפשר מדידה של בחירת נתיב התיקון בתאים סומטיים. ברקע שאינו מוטנטי, NHEJ עם עיבוד מתרחש ב-59.0% מאירועי התיקון הניתנים לזיהוי, ו-HR מתרחש ב-41.0% (איור 4B&#160;ו קובץ משלים 4). ל-CtIP תפקיד חשוב ביזום תיקון HR על ידי קידום resection של קצות ה-DNA20. בהתאם לכך, ברקע DmCtIP-/- , בחירת נתיב HR מופחתת באופן ניכר בתאים סומטיים, מ-41.0% בביקורות הטרוזיגוטיות ל-10.9% במוטנטים הומוזיגוטים (איור 4B ו קובץ משלים 4)16. נתון זה מרמז שב-Drosophila, CtIP תורם לתיקון HR, אך אינו חיוני עבורו.
<img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig1.jpg" /> 
איור 1: מערך דגימה של רפורטר DR-white ל-DSB ותוצרי תיקון. מערך ה-Direct Repeat of white מכיל שני עותקים לא תפקודיים של הגן white: Sce.white (עם הכנסה של 23-bp המכילה את אתר הזיהוי של I-SceI ומכניסה קודון עצירה מוקדם) ו-iwhite (רצף תורמק שנקטע בקצוות 5′ ו-3′). הכלאה של זבובים המכילים DR-white וטרנסגן I-SceI יוצרת DSB ספציפי לאתר שניתן לנתח באופן פנוטיפי או מולקולרי. הפנוטיפים המתוצאים הם (A) צאצאים בעלי עיניים לבנות (y+ w−), המעידים על היעדר DSB, HR בין כרומטידות אחיות, או NHEJ; (B) צאצאים בעלי עיניים אדומות (y+ w+), המעידים על HR תוך-כרומוזומלי המשחזר את רצף ה-wild-type SacI מהתורם iwhite; ו-(C) צאצאים בעלי גוף צהוב ועיניים לבנות (y− w−), המעידים על SSA או CO מיטוטי. האיור עובד על פי Do et al.14. קיצורים: CO = crossover; DR-white = Direct Repeat of white; DSB = double-strand break; HR = homologous recombination; NHEJ = nonhomologous end joining; SSA = single-strand annealing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig2.jpg" /> 
איור 2: נגזרות של בדיאת DR-white. (A) בדיאת DR-white.mu מכילה 28 SNPs שקטים ברצף התורם iwhite.mu, המייצרים 1.4% שוני רצפי בין החזרות הישירות. המרת גנים של פולימורפיזמים בודדים משתנה בין אירועי HR וניתן לקבוע אותה על ידי ריצוף. (B) DR-white עם התורם iwhiteΔ9 מבדילה בין רקומבינציה בין-הומולוגית לרקומבינציה תוך-כרומוזומלית. HR מהתורם התוך-כרומוזומלי iwhite משחזר את רצף SacI הפראי ומייצר צאצאים בעيون אדומות. HR מהתורם הבין-הומולוגי iwhiteΔ9 מייצר צאצאים בעيون כתומות מכיוון שהמחיקה של 9-bp מפחיתה את ביטוי white. האיור הותאם מ-Do et al.14 ו-Fernandez et al.15. קיצורים: DSB = double-strand break; HR = homologous recombination; SNP = single-nucleotide polymorphism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig3.jpg" /> 
איור 3: תהליך העבודה הניסיוני לזיהוי תוצאות תיקון DSB בקו הנבט הפרה-מיוטי. (A) הצלבה 1 משלבת את דגיש ה-DR-white (או נגזרת שלו) עם טרנסגן I-SceI (בדוגמה זו, על הכרומוזום השני). צאצאים הנושאים הן את בדיקת ה-DR-white והן את טרנסגן ה-I-SceI שומרים על אירועי תיקון ברקמות הנבט והסומטיקה שלהם. כדי לנתח אירועי תיקון בודדים בקו הנבט הפרה-מיוטי, צאצאים הנושאים את שני הטרנסגנים מוצלבים עם זבובים בוחנים מסוג y w (הצלבה 2), והצאצאים נספרים כפי שמתואר באיור 1. (B) אירועי תיקון DSB בודדים בקו הנבט בזבובים מסוג wild-type (n = 106 קווי נבט) ובמוטנטים הומוזיגוטים ל-DmRad51 (n = 46 קווי נבט). **P &#60; 0.01; ****P &#60; 0.0001 לפי ANOVA דו-כיווני ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Sidak. סרגים מייצגים ממוצעים; סרגי שגיאה מייצגים SEM. הנתונים נותחו מחדש מתוך Do et al.14. קיצורים: ANOVA = ניתוח שונות; CO = crossover; DSB = double-strand break; HR = רקומבינציה הומולוגית; NHEJ = nonhomologous end joining; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע; SSA = single-strand annealing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig4v2.jpg" /> 
איור 4: זרימת עבודה ניסיונית לזיהוי תוצאות תיקון DSB באמצעות Tracking of Indels by DEcomposition. (A) זבובים הנושאים DR-white וטרנסגן I-SceI מושרה נבדקים באמצעות מיצוי gDNA, הגברה ב-PCR על פני אתר ה-DSB, ריצוף סנגר וניתוח TIDE באמצעות סקריפט R. (B) נתונים מייצגים ממוטנטים DmCtIP-/-&#160; (n = 23) ומביקורות הטרוזיגוטיות DmCtIP+/-&#160; (n = 31). אירועי תיקון ניתנים לזיהוי מחושבים כ-HR פלוס NHEJ עם עיבוד, למעט מקרים ללא DSB/NHEJ ללא indels. ****P &#60; 0.0001 לפי two-way ANOVA ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Sidak. סרגים מייצגים ממוצעים; סרגי שגיאה מייצגים SEM. הנתונים נותחו מחדש מתוך Thomas et al.16. קיצורים: ANOVA = analysis of variance; DSB = double-strand break; gDNA = genomic DNA; HR = homologous recombination; NHEJ = nonhomologous end joining; PCR = polymerase chain reaction; SEM = standard error of the mean; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig4largev2.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: סקריפט TIDE ב-R לזיהוי insertions ו-deletions בكرומטוגרמות של רצפים ביחס לבקרת no-DSB. שם הקובץ של הבקרה, שמות קובצי הדגימות ורצף המטרה של I-SceI הניתנים לעריכה על ידי המשתמש מסומנים לקראת סוף הסקריפט. הקלטים הנדרשים, קובצי הפלט והפרשנות מתוארים בסעיף 2.3. נדרשות חבילות sangerseqR ו-Biostrings.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 1.R" target="_blank">נא ללחוץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: מדריך צילומי מסך שלב-אחר-שלב לזרימת העבודה של סקריפט TIDE R. הפאנלים ממחישים את פעולות התוכנה המתוארות בסעיף 2.3.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 2 (1).pdf" target="_blank">אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: דוגמה לפלט TIDE וחישובי אירועי תיכון. ערך ה-0-indel מייצג היעדר DSB או NHEJ ללא indels; השורה הנפרדת של HR מייצגת את תוצר המחיקה הקנוני של 23-bp; וכל אחוזי ה-indel הנותרים מסוכמים כ-NHEJ עם עיבוד. סך התיכון הניתן לגילוי מחושב כ-HR פלוס NHEJ עם עיבוד.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 3.xlsx" target="_blank">אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ משלים 4: נתונים גולמיים העומדים בבסיס איור 3B ואיור 4B, מאורגנים בגיליונות עבודה נפרדים הניתנים לעריכה. נתונים אלו נותחו מחדש מתוך מחקרים שפורסמו בעבר וצוטטו במקראי האיורים המתאימים.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File S4_R1_v2.pdf" target="_blank">אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.</a>

בדיקת DR-white היא בדיקת דוח (reporter) גנטית רב-גונית לזיהוי תוצאות תיקון של שברים דו-גדיליים ב-DNA באורגניזם רב-תאי מסוג Drosophila melanogaster.

מדידת תיקון שברים דו-גדיליים ב-DNA באמצעות בדיקת DR-white ב-Drosophila melanogaster

מחקרים מסורתיים בתיקון שברים דו-גדיליים (DSB) ב-DNA מוגבלים לעיתים קרובות לחקירות ביוכימיות או למערכות חד-תאיות (למשל, תאים, ...

המעבדה שלנו מתעניינת בתחום של שלמות הגנום, תוך התמקדות באופן שבו תאים מתקנים שברים דו-גדיליים ב-DNA. בניגוד לבדיקות אחרות לתיקון DNA, בדיקת ה-Drosophila DR-white מודדת תיקון של שברים דו-גדיליים בהקשרים רב-תאיים, כולל תאי סומה ותאי נבט.לאחר השלמת ההכלאות הגנטיות והשראת השברים הדו-גדיליים, יש להמתין להבשלת צאצאי הכלאת הבדיקה. החל מהופעת הזבובים הראשונים, יש לבצע דירוג של הצאצאים לאורך כ תשעה ימים. הרדימו את הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני, או העבירו אותם לבקבוקון ריק ללא מזון והקפיאו אותם בטמפרטורה של -20 °C למשך 30 דקות לפחות. הניחו את הזבובים על משטח עבודה לזבובים. לצורך הדירוג, זהו את הזבובים הנושאים את החזרה הישירה של קסטת ה-white או DR-white באמצעות פלואורסצנציית RFP. דרגו את צבע העין ואת צבע הגוף. הטרנסגן y-plus המקושר לקסטת ה-DR-white יוצר גוון גוף חום בינוני שאינו מסוג ברי מלא. השוו זבובים אלו לצאצאים עם גוף צהוב ועיניים לבנות השליליים ל-RFP וחסרים את כרומוזום ה-DR-white, כדי להבחין בין מצב של היעדר שבר דו-גדילי או חיבור קצוות לא הומולוגי (NHEJ) לבין איחוי גדיל בודד (SSA). סווגו זבובים עם גוף כהה וחום יותר ככאלה ללא שבר דו-גדילי או עם חיבור קצוות לא הומולוגי. כללו במערך הנתונים רק בקבוקונים שבהם דורגו לפחות 20 זבובים.עבור הניתוח המולקולרי של אירועי התיקון, אספו את הזבובים שעברו הלם תרמי ונושאים הן את ה-DR-white והן את ה-I-SceI transgenes, כפי שנעשה בצאצאים של Cross 1. הניחו זבובים בודדים לתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5-milliliter והקפיאו את הדגימות בהקפאה מהירה (flash freeze) באמבט של קרח יבש ואתנול. הומוגניזו כל דגימה ב-50 microliters של buffer A באמצעות הומוגניזטור חשמלי. לאחר מכן, דגרו את הדגימות באמבט מים בטמפרטורה של 65 degrees Celsius למשך 30 דקות. הוסיפו 100 microliters של buffer B לכל דגימה וערבבו קצרות על ידי היפוך המבחנות. דגרו את הדגימות על קרח למשך 30 דקות לפחות, ולאחר מכן סובבו אותן בצנטריפוגה במהירות של כ-16,000 g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius. העבירו 125 microliters מהעליון (supernatant) הצלול למבחנת מיקרוצנטריפוגה חדשה של 1.5-milliliter, תוך הימנעות מכל משקע. הוסיפו 100 microliters של isopropanol וערבבו קצרות על ידי היפוך המבחנה. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של כ-16,000 g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שאבו את העליון, תוך הקפדה לא להפריע למשקע ה-DNA. שטפו את המשקע עם 250 microliters של 70% ethanol קר מאוד, וערבבו בעדינות על ידי היפוך המבחנה. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של כ-16,000 g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius ושאבו שוב את העליון. השאירו את המבחנה פתוחה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר אידוי של שאריות האתנול מבלי לייבש את המשקע יתר על המידה. לאחר מכן, הוסיפו 20 microliters של nuclease-free water ואפשרו למשקע להתרחב (reconstitute) במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 degrees Celsius. למחרת, הקישו בעדינות על המבחנה כדי לערבב ומדדו את ריכוז ה-DNA.בצע הגברה של אזור Sce.white באמצעות PCR, תוך שימוש ב-100 nanograms של DNA גנומי ובפריימרים forward ו-reverse של DR- white. הוסף DNA גנומי מזבוב ביקורת DR- white שאינו מכיל את הטרנסגן I-SceI, ולאחר מכן הרץ את התגובה בתנאי מחזור מתאימים. הרץ כ-2 microliters של תוצר ה-PCR על ג'ל 1% Tris-acetate-EDTA כדי לאשר את הגברת Sce.white. ודא כי גודל האמפליקון הוא כ-1.7 kilobases, ולאחר מכן טהר את אמפליקוני Sce.white. מדוד את ריכוז ה-DNA ובצע ריצוף לתוצר ה-PCR המטוהר באמצעות פריימר הריצוף של DR- white.לאחר הורדת חבילות ה-R הנדרשות, בחן את כרומטוגרמות הרצפים ובחר לניתוח רק את אלו עם רקע מועט או ללא רקע לפני אתר השבירה. הורד את קבצי עקבי הרצף עם סיומת .ab1. מקם את כולם בתיקייה אחת במחשב ופשט את שמות קבצי הרצף ככל האפשר. פתח את סקריפט ה-R של Tracking of Indels by DEcomposition או TIED בסביבת הפיתוח המשולבת RStudio. בחלונית המקור (source pane), אתר את השורה המתחילה ב-control והזן את שם קובץ רצף הביקורת בדיוק כפי ששמרת אותו, כולל הסיומת, בתוך מרכאות. אתר את השורה המתחילה ב-sample name והזן את שם קובץ רצף הדגימה של כל דגימה בתוך הסוגריים, כאשר כל שם קובץ נמצא בתוך מרכאות נפרדות ומופרד בפסיקים. לאחר מכן, שמור את סקריפט ה-TIED R הערוך באותה תיקייה שבה נמצאים הרצפים המיועדים לניתוח. בסביבת הפיתוח המשולבת, נווט לתיקיית ה-TIED באמצעות לשונית Files בחלונית הפלט (output pane). לחץ על התפריט הנפתח More ובחר ב-Open New Terminal Here. בטרמינל שנפתח, הקלד R ולחץ על Enter. ברגע ש-R פועל, הרץ את סקריפט ה-TIED R על ידי הקלדת פקודת source עם שם קובץ הסקריפט ולחיצה על Enter. הסקריפט מייצר ייצוג גרפי וקובץ ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) המכיל את הנתונים הגולמיים עבור כל דגימה. פתח כל קובץ CSV ופרש את הנתונים הגולמיים כפרופורציות של indels ברצף הדגימה. לבסוף, זהה את מחיקת 23-base-pair הקנונית המדווחת בנפרד בתחתית הפלט כערך הרקומבינציה ההומולוגית. פרש את ערך ה-0 indel כהעדר שבירה של גדיל כפול או חיבור קצוות לא הומולוגי ללא indels, וסכם את ערכי ה-indel הנותרים כדי לקבוע חיבור קצוות לא הומולוגי עם עיבוד.ניסויי קו נבט מוצלחים הניבו את מחלקות הפנוטיפ הצפויות ולפחות 20 צאצאים הניתנים לדירוג לכל בקבוקון. בזבובים מסוג בר (wild-type) המבטאים I-SceI הניתן להשראה על ידי הלם תרמי, רקומבינציה הומולוגית התרחשה בכ-38.5% מהצאצאים, בהשוואה ל-3.2% עבור חיבור רצפים בודדים (single-strand annealing). ברקע של מוטציה הומוזיגוטית ב-DmRad51, תיקון באמצעות רקומבינציה הומולוגית הופחת לכ-1.3%, עם עלייה נלווית בתיקון באמצעות חיבור רצפים בודדים לכ-34.5%. בתאים סומטיים של רקע שאינו מוטנטי, חיבור קצוות לא הומולוגי עם עיבוד (non-homologous end joining with processing) היו אחראים לכ-59% מאירועי התיקון הניתנים לזיהוי, ורקומבינציה הומולוגית ל-41%. ברקע של מוטציה הומוזיגוטית ב-DmCtIP, הבחירה במסלול של רקומבינציה הומולוגית הופחתה ל-10.9%.ניתן להחיל פרוטוקול זה על רקמות שונות, שלבי התפתחות ומיקומים גנומיים שונים כדי לקבוע גורמים המשפיעים על התיקון. בנוסף, בדיקה זו הותאמה למדידת תוצאות תיקון, כגון אורכי מסלול של המרת גנים (gene conversion) והעדפה של תבנית תיקון. ניתן להשתמש בבדיקת תיקון DNA זו כדי לקבוע גורמים שונים המעורבים בתיקון באמצעות מוטנטים גנטיים ב-Drosophila.

measuring-dna-double-strand-break-repair-using-dr-white-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מאמר זה מתאר GFP מבוססי...

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת המיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי כדי לזהות חלבונים ספציפיים של תגובת נזק לדנ"א הממוקמים באתרים של שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאים חד-גרעיניים אנושיים. החלבונים מזוהים על ידי נוגדנים ראשוניים ספציפיים, אשר בתורם נקשרים לנוגדנים משניים המתויגים בפלואורופור הפולטים פלואורסצנט במהלך הדמיה מיקרוסקופית, ומאפשרים הדמיה של החלבונים כמוקדים פלואורסצנטיים נפרדים בתוך גרעיני התא.

מיקרוסקופ אימונופלואורסנציה לניתוח שברים דו-גדיליים של DNA

האפידרמיס העוברי של עוברי דרוזופילה שלב מאוחר מאוד מספק מערכת vivo בתגובה לניתוח פצע מהיר ויכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות או טיפולי microinjection כימיים לקידום מחקרים בריפוי פצעים לתרגום למודלים של יונקים.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות גישה גנטית הקדמי למסך עבור מוטציות המציגות ניוון נוירוזוסופילה מלאנוגסטר. היא משלבת שיטת טיפוס, ניתוח היסטולוגיה, מיפוי גנים ורצפי דנ א בסופו של דבר לזהות גנים חדשניים הקשורים לתהליך של הגנה עצבית.

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

פרוטוקול זה נועד להעריך את הכדאיות של דרוסופילה בכל שלב התפתחותי, מעובר למבוגר. ניתן להשתמש בשיטה כדי לקבוע ולהשוות בין הכדאיות של גנוסוגים שונים או תנאי גדילה.

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

שלמות מכשול הדם במוח. היא קריטית לתפקוד מערכת העצבים בדרוזופילה מלאנוסטר, מכשול המוח בדם נוצר על ידי תאי גלאל במהלך הembryogenesis המאוחרות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיפול בתפקוד ותחזוקה של מחסומי מוח בדם בד. מלאנוגסטר עוברים והזחלים השלישי.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים כיצד לדמיין כריתת קצה דו-גדילית של דנ"א במהלך שלב S/G2 של מחזור התא באמצעות שיטה מבוססת אימונופלואורסצנטיות.

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

פרוטוקול זה מתאר בדיקת הצטרפות קצה חוץ-כרומוזומלית לא הומולוגית (NHEJ) ובדיקת רקומבינציה הומולוגית (HR) כדי לכמת את היעילות של NHEJ ו- HR בתאי HEK-293T.

ניתוח של חיבור קצה לא הומולוגי ויעילות רקומבינציה הומולוגית בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP

אנו מציגים פרוטוקולים להערכת מיומנות מסלול תיקון שבר גדיל כפול בתאים באמצעות חבילה של מצעי כתב חוץ-כרומוזומליים מבוססי לומינסנציה.

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

למד את שיטת DR-white למדידת תיקון שברים דו-גדיליים ב-DNA ב-Drosophila melanogaster. פרוטוקול זה מאפשר חקירת מנגנוני תיקון ביצורים רב-תאיים והבחנה בין נתיבי HR, NHEJ ו-SSA.

מדידת תיקון שברים דו-גדיליים ב-DNA באמצעות בדיקת DR-white ב-Drosophila melanogaster

גלה סרטונים נוספים