Name: protein purification with sec and imac
Uploaded: 2023-04-30T06:30:54.000Z
Duration: 7 min 51 s
Channel: JoVE

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Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

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Chromatography-based Biomolecule Purification Methods

In biochimica, i metodi di purificazione basati sulla cromatografia sono impiegati per isolare i composti da una miscela complessa. Due di questi metodi usati comunemente dai biochimici sono la cromatografia ad esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità. Nella cromatografia ad esclusione dimensionale, una colonna piena di perle porose separa i componenti di una miscela in base alle dimensioni. D'altra parte, la cromatografia di affinità consente una separazione più specifica delle biomolecole utilizzando una colonna composta da fase stazionaria, che contiene ligandi specifici del bersaglio.
Questo video serve come introduzione alla cromatografia di esclusione delle dimensioni e affinità, nonché ai concetti che li governano. Viene descritta una procedura passo-passo per la purificazione di una proteina marcata con istidina mediante cromatografia di affinità metallica immobilizzata. Sono inoltre profilate le applicazioni per entrambi questi metodi cromatografici in biochimica e nella ricerca biomedica.

metodi di purificazione di biomolecole basati sulla cromatografia

In biochimica, i metodi di purificazione basati sulla cromatografia sono impiegati per isolare i composti da una miscela complessa. Due di questi metodi usati comunemente dai biochimici sono la cromatografia ad esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità. Nella cromatografia ad esclusione dimensionale, una colonna piena di perle porose separa i componenti di una miscela in base alle dimensioni. D'altra parte, la cromatografia di affinità consente una separazione più specifica delle biomolecole utilizzando una colonna composta da fase stazionaria, che contiene ligandi specifici del bersaglio.
Questo video serve come introduzione alla cromatografia di esclusione delle dimensioni e affinità, nonché ai concetti che li governano. Viene descritta una procedura passo-passo per la purificazione di una proteina marcata con istidina mediante cromatografia di affinità metallica immobilizzata. Sono inoltre profilate le applicazioni per entrambi questi metodi cromatografici in biochimica e nella ricerca biomedica.
<div class="chapter_text" id="script_0">
"Cromatografia" si riferisce a una vasta gamma di metodi utilizzati per isolare un componente da una miscela complessa, un passo essenziale prima che le proprietà e le attività di una biomolecola possano essere determinate. Ogni tecnica cromatografica ha un meccanismo di separazione diverso, a seconda della matrice del campione e del composto bersaglio. Questo video si concentrerà sui principi e sul funzionamento di due metodi comuni alla biochimica: l'esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità.
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<div class="chapter_text" id="script_1">
La cromatografia ad esclusione dimensionale o SEC si basa sulla dimensione dei composti nel campione. Una fase mobile contenente il campione viene aggiunta a una colonna con un materiale poroso: la fase stazionaria. Le molecole nel campione rientrano in 1 delle 3 categorie.
Molecole troppo grandi per entrare nei pori percorrono la distanza più breve attraverso la colonna. Qualsiasi specie con un peso molecolare superiore a questo "limite di esclusione" uscirà dalla colonna allo stesso tempo. Le molecole abbastanza piccole da entrare liberamente nei pori saranno trattenute più a lungo e usciranno insieme dalla colonna. Il peso molecolare che consente l'ingresso completo dei pori è il "limite di permeazione".
Solo le molecole tra questi limiti saranno separate l'una dall'altra, poiché trascorrono quantità variabili di tempo a diffondersi dentro e fuori dai pori. Le molecole più piccole vengono trattenute più a lungo sulla colonna perché trascorrono più tempo nella fase stazionaria, mentre le molecole più grandi entro questi limiti escono prima.
I pesi molecolari da 1 a 2 ordini di grandezza rientrano in questi limiti. Le colonne vengono scelte con questo in mente, oppure più colonne possono essere utilizzate in serie se esiste una vasta gamma di composti desiderati.
Ora che hai visto la teoria della SEC, diamo un'occhiata a come viene eseguita.
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<div class="chapter_text" id="script_2">
Per iniziare la procedura SEC, la colonna deve essere bilanciata con acqua deionizzata e tampone cromatografico. Una volta preparato, il buffer contenente il campione viene iniettato sulla colonna. Il buffer viene quindi spinto attraverso a una bassa portata. Un rilevatore monitora ciò che esce dalla colonna per determinare la presenza dell'analita desiderato. Molecole di grandi dimensioni con pesi molecolari superiori al limite di esclusione escono contemporaneamente dalla colonna. Piccole frazioni dalla colonna sono raccolte in tubi. Ogni frazione viene testata per la qualità della molecola bersaglio mediante elettroforesi su gel o altre tecniche analitiche.
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<div class="chapter_text" id="script_3">
Ora diamo un'occhiata alla cromatografia di affinità o AC, uno dei modi più efficienti per purificare le proteine. Molte biomolecole si legano selettivamente a determinati ligandi, una proprietà che AC utilizza aderendo un ligando specifico del bersaglio alla fase stazionaria.
Quando la miscela scorre attraverso la colonna, le molecole bersaglio si attaccano al ligando e il resto scorre attraverso. Dopo che la miscela è passata attraverso la colonna, la molecola bersaglio può essere raccolta attraverso uno dei due metodi di eluizione basati sulla specificità.
Si può dire che l'eluizione biospecifica abbia un ruolo "normale" o "inverso". Nell'eluizione biospecifica a ruolo normale, viene aggiunto un agente che compete con il ligando aderente per legarsi alla biomolecola bersaglio.
Nell'eluizione biospecifica a ruolo inverso, un agente compete con il bersaglio per legarsi al ligando aderente. Il secondo tipo di eluizione, l'eluizione non specifica, abbassa il legame bersaglio-ligando modificando il pH, la forza ionica o la polarità della soluzione. Se una proteina non si lega a un ligando che può essere immobilizzato, la proteina può essere espressa contenente un "tag": brevi sequenze peptidiche progettate per legarsi al ligando.
Una varietà è la cromatografia di affinità ionica metallica immobilizzata, "IMAC" in breve, in cui un ligando metallico aderente, come nichel o cobalto, si lega ai residui di istidina sulla proteina modificata. Attraverso tecniche di biologia molecolare, le proteine bersaglio vengono generate con residui ripetuti di istidina, chiamati tag polistidina, che si legano al metallo attraverso la catena laterale dell'imidazolo sull'istidina. Una volta legata, la proteina può essere raccolta con imidazolo libero tramite eluizione specifica a ruolo inverso e successivamente utilizzata in un'ampia varietà di applicazioni a valle. Ora che hai visto la teoria della cromatografia di affinità, diamo un'occhiata a una procedura IMAC in laboratorio.

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<div class="chapter_text" id="script_4">
In IMAC, la fase stazionaria può essere aggiunta direttamente alla miscela di fase mobile e campione, consentendo il legame della proteina his-tagged. Questo liquame viene quindi versato nella colonna, dove i composti non legati gocciolano nei rifiuti, mentre il liquame rimane. Il contenitore del liquame viene risciacquato per raccogliere la resina residua e il campione, che viene aggiunto alla colonna.
La resina viene agitata per garantire che i componenti non legati siano a flusso libero. Il tampone di lavaggio aggiunto aiuta a lavarli via. Una volta rimossi tutti i componenti non legati, i rifiuti vengono sostituiti con un contenitore per raccogliere la proteina bersaglio.
Il tampone contenente imidazolo viene aggiunto, mescolato e lasciato riposare per slegare la molecola bersaglio. L'imidazolo si lega al metallo, sostituendo e rilasciando la proteina etichettata. La proteina liberata viene raccolta e la fase di imidazolo viene ripetuta per garantire la raccolta totale. Per purificare ulteriormente il campione, SEC può essere eseguito sul campione prima dell'analisi.
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<div class="chapter_text" id="script_5">
Ora che abbiamo visto la teoria e la procedura di queste due tecniche, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui vengono applicate nel campo biochimico.
Un motivo comune per purificare le proteine è studiare il loro ruolo nella malattia. La fibrosi cistica è causata da difetti nella proteina regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica, o CFTR. Dopo aver coltivato la proteina con un his-tag nel lievito, sia l'affinità che la cromatografia di esclusione dimensionale consentono l'isolamento della proteina, seguito dallo studio della sua funzione.
In alcuni casi, la presenza di un tag polistidina può modificare la struttura di una proteina, influenzando così la sua funzione. Un altro tag comune è la proteina legante il maltosio o MBP, che si legherà all'amilosio legato in una colonna. Il maltosio viene quindi utilizzato per rilasciare il complesso. L'MBP può quindi essere scisso e rimosso con SEC per produrre la proteina pura desiderata.
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<div class="chapter_text" id="script_6">
Hai appena visto il video di JoVE sull'esclusione delle dimensioni e la cromatografia di affinità. Ha coperto la teoria delle tecniche, ha esaminato le procedure generali e ha coperto alcuni degli usi delle tecniche.
Grazie per l'attenzione!
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Metodi di purificazione di biomolecole basati sulla cromatografia

In biochemistry, chromatography-based purification methods are employed to isolate compounds from a complex mixture. Two such methods used commonly by ...

La "cromatografia" si riferisce a un'ampia gamma di metodi utilizzati per isolare un componente da una miscela complessa, un passaggio essenziale prima che le proprietà e le attività di una biomolecola possano essere determinate. Ogni tecnica cromatografica ha un meccanismo di separazione diverso, a seconda della matrice del campione e del composto target. Questo video si concentrerà sui principi e sul funzionamento di due metodi comuni alla biochimica: la cromatografia ad esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità.La cromatografia ad esclusione dimensionale o SEC si basa sulle dimensioni dei composti nel campione. Una fase mobile contenente il campione viene aggiunta a una colonna con un materiale poroso: la fase stazionaria. Le molecole nel campione rientrano in 1 delle 3 categorie.Le molecole troppo grandi per entrare nei pori percorrono la distanza più breve attraverso la colonna. Tutte le specie con un peso molecolare superiore a questo "limite di esclusione" usciranno contemporaneamente dalla colonna. Le molecole abbastanza piccole da entrare liberamente nei pori verranno trattenute più a lungo e usciranno insieme dalla colonna. Il peso molecolare che consente l'ingresso completo dei pori è il "limite di permeazione".Solo le molecole tra questi limiti saranno separate l'una dall'altra, poiché trascorrono quantità variabili di tempo a diffondersi dentro e fuori dai pori. Le molecole più piccole vengono trattenute più a lungo sulla colonna perché trascorrono più tempo nella fase stazionaria, mentre le molecole più grandi entro questi limiti escono prima.I pesi molecolari compresi tra 1 e 2 ordini di grandezza rientrano in questi limiti. Le colonne vengono scelte tenendo presente questo aspetto, oppure è possibile utilizzare più colonne in serie se esiste un'ampia gamma di composti desiderati.Ora che hai visto la teoria della SEC, diamo un'occhiata a come viene eseguita.Per iniziare la procedura SEC, la colonna deve essere bilanciata con acqua deionizzata e tampone cromatografico. Una volta preparato, il tampone contenente il campione viene iniettato sulla colonna. Il tampone viene quindi spinto a bassa portata. Un rivelatore monitora ciò che esce dalla colonna per determinare la presenza dell'analita desiderato. Contemporaneamente dalla colonna escono molecole di grandi dimensioni con pesi molecolari superiori al limite di esclusione. Piccole frazioni dalla colonna vengono raccolte in tubi. Ogni frazione viene testata per la qualità della molecola bersaglio mediante elettroforesi su gel o altre tecniche analitiche.Ora diamo un'occhiata alla cromatografia di affinità o AC, uno dei modi più efficienti per purificare le proteine. Molte biomolecole si legano selettivamente a certi ligandi, una proprietà che l'AC utilizza facendo aderire un ligando specifico alla fase stazionaria.Quando la miscela scorre attraverso la colonna, le molecole bersaglio si attaccano al ligando e il resto fluisce attraverso. Dopo che la miscela è passata attraverso la colonna, la molecola bersaglio può essere raccolta attraverso uno dei due metodi di eluizione in base alla specificità.Si può dire che la bioeluizione abbia un ruolo "normale" o "inverso". Nell'eluizione biospecifica a ruolo normale, viene aggiunto un agente che compete con il ligando aderente per legarsi con la biomolecola bersaglio.Nell'eluizione biospecifica a ruolo inverso, un agente compete con il bersaglio per legarsi al ligando aderito. Il secondo tipo di eluizione, l'eluizione "non specifica", riduce il legame bersaglio-ligando modificando il pH, la forza ionica o la polarità della soluzione. Se una proteina non si lega a un ligando che può essere immobilizzato, la proteina può essere espressa contenente un "tag": brevi sequenze peptidiche ingegnerizzate per legarsi al ligando.Una varietà è la cromatografia di affinità con ioni metallici immobilizzati, "IMAC" in breve, in cui un legante metallico aderito, come il nichel o il cobalto, si lega ai residui di istidina sulla proteina modificata. Attraverso tecniche di biologia molecolare, le proteine bersaglio vengono generate con residui ripetuti di istidina, chiamati tag poliistidinici, che si legano al metallo attraverso la catena laterale dell'imidazolo sull'istidina. Una volta legata, la proteina può essere raccolta con l'imidazolo libero tramite eluizione specifica a ruolo inverso e successivamente utilizzata in un'ampia varietà di applicazioni a valle. Ora che hai visto la teoria della cromatografia di affinità, diamo un'occhiata a una procedura IMAC in laboratorio.Nell'IMAC, la fase stazionaria può essere aggiunta direttamente alla miscela di fase mobile e campione, consentendo il legame della proteina marcata con his. Questo impasto viene quindi versato nella colonna, dove i composti non legati gocciolano nei rifiuti, mentre il liquame rimane. Il contenitore del liquame viene risciacquato per raccogliere la resina residua e il campione, che viene aggiunto alla colonna.La resina viene agitata per garantire che i componenti non legati scorrano liberamente. L'aggiunta di un tampone di lavaggio aiuta a sciacquarli. Una volta rimossi tutti i componenti non legati, i rifiuti vengono sostituiti con un contenitore per raccogliere la proteina bersaglio.Il tampone contenente imidazolo viene aggiunto, mescolato e lasciato riposare per slegare la molecola bersaglio. L'imidazolo si lega al metallo, sostituendo e rilasciando la proteina marcata. La proteina liberata viene raccolta e il passaggio dell'imidazolo viene ripetuto per garantire la raccolta totale. Per purificare ulteriormente il campione, il SEC può essere eseguito sul campione prima dell'analisi.Ora che abbiamo visto la teoria e la procedura di queste due tecniche, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui vengono applicate in campo biochimico.Un motivo comune per purificare le proteine è studiare il loro ruolo nelle malattie. La fibrosi cistica è causata da difetti nella proteina regolatrice della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica, o CFTR. Dopo aver coltivato la proteina con un his-tag nel lievito, sia la cromatografia di affinità che quella ad esclusione dimensionale consentono l'isolamento della proteina, seguita dallo studio della sua funzione.In alcuni casi, la presenza di un tag poliistidina può modificare la struttura di una proteina, influenzandone così la funzione. Un altro tag comune è la proteina legante il maltosio o MBP, che si lega all'amilosio legato in una colonna. Il maltosio viene quindi utilizzato per rilasciare il complesso. L'MBP può quindi essere scisso e rimosso con SEC per produrre la proteina pura desiderata.Hai appena guardato il video di JoVE sull'esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità. Copriva la teoria delle tecniche, esaminava le procedure generali e copriva alcuni degli usi delle tecniche.Grazie per l'attenzione!

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protein purification with sec and imac

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC.

Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A sample moves through a column packed with porous beads, which make up the stationary phase. Large molecules that cannot enter the pores travel the shortest path and leave first. Smaller molecules enter the pores, spend more time in the column, and leave later. Molecules between the exclusion limit and the permeation limit can be separated from each other, while molecules above or below those limits exit together.

The SEC procedure begins with equilibration of the column using deionized water and chromatography buffer. Sample-containing buffer is then injected, and the liquid is pushed through at a low flow rate. A detector watches what comes out of the column, and fractions are collected in tubes. These fractions can then be checked for the target molecule by gel electrophoresis or other analytical methods.

Affinity chromatography, or AC, uses the fact that many biomolecules bind selectively to certain ligands. In this method, a target-specific ligand is attached to the stationary phase. As the mixture passes through the column, the target binds to the ligand while the rest flows through. The target can then be released by biospecific elution, which may use a competing agent in normal-role or reverse-role form, or by nonspecific elution, which changes pH, ionic strength, or polarity.

If a protein does not naturally bind to an immobilized ligand, it can be engineered with a tag. A common example is a polyhistidine tag, or his-tag. In immobilized metal ion affinity chromatography, nickel or cobalt on the column binds to histidine residues through the imidazole side chain. The tagged protein is then released with free imidazole by reverse-role specific elution and can be used in downstream applications.

The IMAC procedure begins by mixing the stationary phase with the sample so the his-tagged protein can bind. The slurry is poured into the column, and unbound material drains to waste. The resin is rinsed into the column, stirred, and washed to remove leftover unbound components. After that, a container is placed to collect the target protein, and imidazole buffer is added to release it. The imidazole binds the metal, displaces the tagged protein, and the collected step may be repeated to improve recovery. For further cleanup, SEC can be run before analysis.

These purification methods are useful in biochemical and biomedical research. One example is cystic fibrosis research, where the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein, or CFTR, is grown with a his-tag in yeast and then isolated with affinity and size-exclusion chromatography. In some cases, a polyhistidine tag can change protein structure and affect function. Another tag used in protein work is maltose-binding protein, or MBP, which binds amylose in a column and is released with maltose. The MBP can then be cleaved and removed with SEC to produce the desired pure protein.

Protein Purification with SEC and IMAC

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

Questa collezione descrive i metodi di purificazione più comunemente utilizzati, come la cromatografia per affinità, così come i metodi analitici, come il MALDI-TOF. Inoltre, i video mostrano i metodi per valutare l'interazione e la funzione delle biomolecole, quali la co-immunoprecipitazione e l'etichettatura metabolica.

Explore how size-exclusion chromatography and IMAC separate proteins by size or binding, and see how tagged proteins are purified for research.

Protein Purification with SEC and IMAC | JoVE K12

Overview

Size-Exclusion Chromatography

Operation of Size-Exclusion Chromatography

Affinity Chromatography

Operation of Affinity Chromatography

Applications

Summary

What is Photosynthesis?

Photosynthesis is a multipart, biochemical process that occurs in plants as well as in some bacteria. It captures carbon dioxide and solar energy to ...

Light as Energy

The energy required to carry out photosynthesis is light&#8212; typically electromagnetic radiation from the sun. The range of all possible wavelengths is ...

Anatomy of Chloroplasts

Green algae and plants, including green stems and unripe fruit, harbor chloroplasts&mdash;the vital organelles where photosynthesis takes place. In ...

Photosystem II

The multi-protein complex photosystem II (PS II) harvests photons and transfers their energy through its bound pigments to its reaction center, and ...

Photosystem I

Although structurally similar to photosystem II (PSII), photosystem I (PSI) is has a different electron supplier and electron acceptor.
Both these ...

The Calvin Cycle

Overview

Oxygenic photosynthesis converts approximately 200 billion tons of carbon dioxide (CO2) annually to organic compounds and produces approximately ...

C4 Pathway and CAM

Most plants use the C3 pathway for carbon fixation. However, some plants, such as sugar cane, corn, and cacti that grow in hot conditions, use alternative ...

the-z-scheme-of-electron-transport-in-photosynthesis

The Z-Scheme of Electron Transport in Photosynthesis

The light reactions of photosynthesis assume a linear flow of electrons from water to NADP+. During this process, light energy drives the splitting of ...

Photosynthesis

Autotrophs

Almost all living organisms on Earth depend on photosynthesis, which is the process that converts sunlight energy into a simple sugar called ...

Plant Pigment Chromatography and Floating Leaf Discs in a Vacuum
ExpandOn the day before the experiment, fill a container with water.
Place the spinach ...

Plant Pigment Chromatography
ExpandNOTE: In this experiment you will separate pigments from spinach leaves using chromatography paper. Individual pigments ...

First Law of Thermodynamics

The First Law of Thermodynamics states that energy cannot be created or destroyed, only transformed. This can be demonstrated within a classic food web ...

Photosystems

Photosystems are multiprotein complexes that form the functional units of photosynthesis in plants, algae, and cyanobacteria. They are found embedded in ...

An Introduction to Cell Metabolism

In cells, critical molecules are either built by joining together individual units like amino acids or nucleotides, or broken down into smaller ...

Reconstitution of Membrane Proteins

Reconstitution is the process of returning an isolated biomolecule to its original form or function. This is particularly useful for studying membrane ...

Use a model to illustrate how photosynthesis transforms light energy into stored chemical energy.

HS-LS1-5.

Macromolecules

Biomolecules
Organisms contain a wide variety of organic molecules with numerous functions which depend on the chemical structures and properties of these ...

Solution Preparation
ExpandCAUTION: It is important to always use care when handling reagents. For example, iodine will stain clothes and skin so wear ...

Identifying Macromolecules with Indicator Solutions
ExpandHYPOTHESES: In this activity, the experimental hypothesis might be that the addition of an ...

Introduction to Carbohydrates

Carbohydrates, proteins, and fats are the primary macronutrients in the human diet. However, carbohydrates are the most favored source of energy in the ...

Carbohydrate Metabolism

Sugars as Energy Storage Molecules

Chemistry of Carbohydrates

Carbohydrates are an essential part of the diet in humans and animals. Grains, fruits, and vegetables are natural sources of carbohydrates that provide ...

Oligosaccharide Assembly

Protein glycosylation starts in the ER lumen and continues in the Golgi apparatus. Glycosyltransferases catalyze the addition of sugar molecules or ...

What are Lipids?

lipid-derived-compounds-in-the-human-body

Lipid-derived Compounds in the Human Body

Fats and lipids are crucial components in the human body. Some lipid-derived compounds, such as fat-soluble vitamins, eicosanoids, lipoproteins, and ...

Fats as Energy Storage Molecules

Structure of Lipids

Lipids include a diverse group of compounds that are largely nonpolar in nature. This is because they are hydrocarbons that include mostly nonpolar ...

Proteins and Amino Acids

Overview

Proteins are chains of amino acids that are connected by peptide bonds and folded into a 3-dimensional structure. The side chains of individual ...

Amino acids

Amino acids are the monomers that comprise proteins. Each amino acid has the same fundamental structure, which consists of a central carbon atom, or the ...

Peptide Bonds

A peptide bond covalently attaches amino acids through a dehydration reaction. One amino acid&#39;s carboxyl group and another amino acid&#39;s amino ...

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

Conditions on Early Earth

Around 4 billion years ago, oceans began to condense on earth while volcanic eruptions released nitrogen, carbon dioxide, methane, ammonia, and hydrogen ...

ATP and Macromolecule Synthesis

Biological macromolecules are organic compounds, predominantly composed of carbon atoms. The carbon atoms are covalently bonded with hydrogen, oxygen, ...

Dietary Connections

In biological systems, most metabolic pathways are interconnected. The cellular respiration processes that convert glucose to ATP&#8212;such as ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

Overview of Nitrogen Metabolism

Nitrogen is a very important element for life because it is a major constituent of proteins and nucleic acids. It is a macronutrient, and in nature, it is ...

Compounds Essential to Human Function

The human body is composed of cells that are fundamentally made up of several different molecules. These molecules are essential to carry out all ...

an-introduction-to-molecular-developmental-biology

An Introduction to Molecular Developmental Biology

Molecular signals play a major role in the complex processes occurring during embryonic development. These signals regulate activities such as cell ...

Dehydration Synthesis

Dehydration synthesis (also called a condensation reaction) is the chemical process in which two molecules covalently link together to form a new ...

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An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

All living organisms on Earth are directly or indirectly dependent on photosynthesis. It is the only biological process that can capture energy from ...

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An Overview of Alkenone Biomarker Analysis for Paleothermometry

Source: Laboratory of Jeff Salacup&#160;- University of Massachusetts Amherst
Throughout this series of videos, natural samples were extracted and ...

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An Introduction to Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a microscopic, soil-dwelling roundworm that has been powerfully used as a model organism since the early 1970&rsquo;s.  It was ...

An Overview of Epigenetics

Since the early days of genetics research, scientists have noted certain heritable phenotypic differences that are not due to differences in the ...

An Introduction to Cell Death

Necrosis, apoptosis, and autophagic cell death are all manners in which cells can die, and these mechanisms can be induced by different stimuli, such as ...

An Overview of Gene Expression

Gene expression is the complex process where a cell uses its genetic information to make functional products. This process is regulated at multiple ...

An Introduction to Cell Division

Cell division is the process by which a parent cell divides and gives rise to two or more daughter cells. It is a means of reproduction for single-cell ...

An Overview of Genetic Analysis

An organism&#8217;s physical traits, or phenotype, are a product of its genotype, which is the combination of alleles (gene variants) inherited from its ...

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An Introduction to Cell Motility and Migration

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

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An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience

Cellular and molecular neuroscience is one of the newest and fastest growing subdisciplines in neuroscience. By investigating the influences of genes, ...

An Overview of Genetics and Disease

Many human diseases are associated with mutations or variations in genetic sequences. Some of these genetic variants are heritable, passed down from ...

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An Introduction to Developmental Genetics

Development is the complex process through which a single-celled embryo transforms into a multicellular organism. Developmental processes are guided by ...

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An Overview of bGDGT Biomarker Analysis for Paleoclimatology

Annexin V and Propidium Iodide Labeling

Staining with annexin V and propidium iodide (PI) provides researchers with a way to identify different types of cell death&#8212;either necrosis or ...

Co-Immunoprecipitation and Pull-Down Assays

Co-immunoprecipitation (CoIP) and pull-down assays are closely related methods to identify stable protein-protein interactions. These methods are related ...

Construct and revise an explanation based on evidence for how carbon, hydrogen, and oxygen from sugar molecules may combine with other elements such as nitrogen, sulfur, and phosphorus to form amino acids and other carbon-based molecules.

Protein Purification with SEC and IMAC

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