Name: detecting protein-dna binding by emsa
Uploaded: 2023-04-30T06:31:38.000Z
Duration: 6 min 57 s
Channel: JoVE

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Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

Il test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) è una procedura biochimica utilizzata per chiarire il legame tra proteine e acidi nucleici. In questo test vengono miscelati un acido nucleico radiomarcizzato e una proteina di prova. Il legame è determinato tramite elettroforesi su gel che separa i componenti in base a massa, carica e conformazione.
Questo video mostra i concetti di EMSA e una procedura generale, tra cui la preparazione di gel e proteine, il legame, l'elettroforesi e il rilevamento. Le applicazioni trattate in questo video includono l'analisi degli enzimi rimodellanti la cromatina, un EMSA modificato che incorpora la biontinilazione e lo studio dei siti di legame dei regolatori della risposta batterica.

saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (emsa)

Il test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) è una procedura biochimica utilizzata per chiarire il legame tra proteine e acidi nucleici. In questo test vengono miscelati un acido nucleico radiomarcizzato e una proteina di prova. Il legame è determinato tramite elettroforesi su gel che separa i componenti in base a massa, carica e conformazione.
Questo video mostra i concetti di EMSA e una procedura generale, tra cui la preparazione di gel e proteine, il legame, l'elettroforesi e il rilevamento. Le applicazioni trattate in questo video includono l'analisi degli enzimi rimodellanti la cromatina, un EMSA modificato che incorpora la biontinilazione e lo studio dei siti di legame dei regolatori della risposta batterica.
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EMSA, il test di spostamento della mobilità elettroforetica, noto anche come test di spostamento del gel, è una procedura biochimica versatile e sensibile. EMSA chiarisce il legame tra proteine e acidi nucleici rilevando uno spostamento delle bande nell'elettroforesi su gel.
Questo video descrive i principi dell'EMSA, fornisce una procedura generale e discute alcune applicazioni.
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La replicazione, la trascrizione e la riparazione del DNA, così come l'elaborazione dell'RNA sono tutti processi biochimici critici. Tutti coinvolgono il legame tra proteine e acidi nucleici. Molte malattie e disturbi gravi sono associati a modifiche in questo legame. L'EMSA è una tecnica per determinare qualitativamente se una proteina specifica si lega a uno specifico acido nucleico. In primo luogo, l'acido nucleico viene etichettato, di solito con fosforo-32 radioattivo, per creare una sonda. Quindi la proteina di prova e la sonda dell'acido nucleico vengono miscelate. Quando una proteina si lega a una sonda di acido nucleico, il complesso risultante ha una massa maggiore e una conformazione diversa rispetto al solo acido nucleico.
Una volta legati, i complessi vengono analizzati con elettroforesi su gel. In questa tecnica, un campo elettrico costringe le macromolecole a migrare attraverso una matrice di gel. I componenti si separano in base a massa, carica e conformazione. L'elettroforesi può separare i complessi proteina-DNA dalle sonde non legate. Poiché hanno masse e conformazioni diverse, migreranno attraverso il gel a velocità diverse e separate. La separazione è facilmente rilevabile, grazie alla presenza del fosforo radioattivo, e dimostra che la proteina si lega con successo all'acido nucleico dato. Per verificare l'identificazione della proteina, un "test supershift" utilizza un anticorpo con un'affinità nota alla proteina. Ciò ha l'ulteriore vantaggio di spostare ulteriormente la risoluzione complessa e crescente.
Ora che abbiamo visto i principi, vediamolo in laboratorio.
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<div class="chapter_text" id="script_2">
Per iniziare la procedura, la proteina deve essere isolata. Per fare questo, le tecniche di biologia molecolare vengono utilizzate per esprimere la proteina nelle cellule e quindi purificare.
L'acido nucleico viene amplificato ed etichettato per creare una sonda. L'etichettatura viene effettuata attraverso l'incubazione per 10 minuti con dCTP contenente fosforo-32 radioattivo. Sono necessari un banco da lavoro sicuro per le radiazioni e dispositivi di protezione.
Il gel viene quindi preparato. Il gel deve essere non denaturante, per evitare che la proteina alteri la conformazione e potenzialmente si slega dalla sonda durante l'elettroforesi. I gel di poliacrilammide hanno dimensioni dei pori da 5 a 20 nm e sono utili per sonde corte fino a 100 paia di basi di lunghezza. I gel di acarosio hanno dimensioni dei pori di 70-700 nm e sono utili per sonde più grandi.
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Con la sonda proteica e dell'acido nucleico ora preparata, si procede al legame. Viene preparata una soluzione tampone TRIS e vengono aggiunte la proteina e la sonda. Il pH dovrebbe essere simile alle condizioni fisiologiche e la concentrazione di sale sufficiente per evitare che la proteina formi legami deboli con acidi nucleici non bersaglio. La reazione procede per 20-30 min a 4 °C.
Il prossimo passo è l'elettroforesi. Viene utilizzato un tampone di bassa resistenza ionica e un pH simile a quello utilizzato nella reazione di legame. Produce un "effetto intasamento" che stabilizza i complessi, aumenta la mobilità e riduce la generazione di calore. Dopo l'elettroforesi, i componenti del gel vengono trasferiti su carta da filtro. In una stanza buia, la carta da filtro viene quindi esposta alla pellicola. Se la proteina si lega alla sonda, nel trasferimento saranno visibili due distinte regioni etichettate. Uno che rappresenta il complesso e uno separato che rappresenta la sonda non legata. La separazione dimostra che la proteina si è legata con successo all'acido nucleico.
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<div class="chapter_text" id="script_4">
Ora che abbiamo visto la procedura di base, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni.
La cromatina è il complesso strettamente imballato di DNA e proteine che si trovano nelle cellule eucariotiche. Gli enzimi rimodellanti la cromatina modificano la struttura per aprire il DNA alla trascrizione. Poiché questo cambia la mobilità del complesso, EMSA può essere utilizzato per esplorare l'attività di legame dell'enzima.
Un approccio alternativo all'etichettatura sfrutta l'interazione tra il DNA e l'enzima metiltransferasi. Un cofattore può essere modificato per legarsi permanentemente al DNA tramite metiltransferasi. Piuttosto che etichettare con fosforo-32, il cofattore è coniugato alla biotina, il che è vantaggioso perché non è radioattivo. Poiché il cofattore è sito-specifico nel suo attaccamento, è rilevante per la genotipizzazione, il rilevamento della metilazione e la consegna genica. Gli acidi nucleici biotinilati vengono rilevati attraverso la fluorescenza ultravioletta.
Quando gli stimoli ambientali attivano le istidina chinasi, un "regolatore di risposta" viene fosforilato. Questo a sua volta si lega al DNA, influenzando la trascrizione, che può essere studiata dall'EMSA. Ad esempio, è stato dimostrato che un regolatore di risposta in Desulfovibrio vulgaris si lega al gene di interesse. L'EMSA è stato utilizzato per verificare che il vincolo abbia avuto luogo.
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<div class="chapter_text" id="script_5">
Hai appena visto il video di JoVE sul test del turno di mobilità elettroforetica. Ora dovresti capire i suoi principi di funzionamento, i passaggi della sua procedura e i suoi principali parametri operativi.
Grazie per l'attenzione!
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Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA)

The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is a biochemical procedure used to elucidate binding between proteins and nucleic acids. In this assay a ...

L'EMSA, il test elettroforetico di spostamento della mobilità, noto anche come saggio di spostamento del gel, è una procedura biochimica versatile e sensibile. EMSA chiarisce il legame tra proteine e acidi nucleici rilevando uno spostamento delle bande nell'elettroforesi su gel. Questo video descrive i principi dell'EMSA, fornisce una procedura generale e illustra alcune applicazioni. La replicazione, la trascrizione e la riparazione del DNA, così come l'elaborazione dell'RNA, sono tutti processi biochimici critici. Tutti coinvolgono il legame tra proteine e acidi nucleici. Molte malattie e disturbi gravi sono associati a modifiche in questo legame. L'EMSA è una tecnica per determinare qualitativamente se una specifica proteina si lega a uno specifico acido nucleico. In primo luogo, l'acido nucleico viene marcato, di solito con fosforo-32 radioattivo, per creare una sonda. Quindi la proteina di prova e la sonda dell'acido nucleico vengono mescolate. Quando una proteina si lega a una sonda di acido nucleico, il complesso risultante ha una massa maggiore e una conformazione diversa rispetto al solo acido nucleico. Una volta legati, i complessi vengono analizzati con l'elettroforesi su gel. In questa tecnica, un campo elettrico costringe le macromolecole a migrare attraverso una matrice di gel. I componenti si separano in base alla massa, alla carica e alla conformazione. L'elettroforesi può separare i complessi proteina-DNA dalle sonde non legate. Poiché hanno masse e conformazioni diverse, migreranno attraverso il gel a velocità diverse e si separeranno. La separazione è facilmente rilevabile, grazie alla presenza del fosforo radioattivo, e dimostra che la proteina si lega con successo all'acido nucleico dato. Per verificare l'identificazione della proteina, un "test supershift" utilizza un anticorpo con un'affinità nota per la proteina. Questo ha l'ulteriore vantaggio di spostare ulteriormente la risoluzione complessa e aumentata. Ora che abbiamo visto i principi, vediamoli in laboratorio. Per iniziare la procedura, la proteina deve essere isolata. Per fare ciò, vengono utilizzate tecniche di biologia molecolare per esprimere la proteina nelle cellule e quindi purificarla. L'acido nucleico viene amplificato ed etichettato per creare una sonda. La marcatura viene effettuata attraverso l'incubazione per 10 minuti con dCTP contenente fosforo-32 radioattivo. Sono necessari un banco da lavoro a prova di radiazioni e dispositivi di protezione. Il gel viene quindi preparato. Il gel deve essere non denaturante, per evitare che la proteina alteri la conformazione e potenzialmente si sganci dalla sonda durante l'elettroforesi. I gel di poliacrilammide hanno dimensioni dei pori da 5 a 20 nm e sono utili per sonde corte fino a 100 coppie di basi di lunghezza. I gel di agarosio hanno dimensioni dei pori di 70-700 nm e sono utili per sonde più grandi. Con la sonda di proteine e acidi nucleici ora preparata, si procede al legame. Viene preparata una soluzione tampone TRIS e vengono aggiunte la proteina e la sonda. Il pH dovrebbe essere simile alle condizioni fisiologiche e la concentrazione di sale sufficiente per evitare che la proteina formi legami deboli con acidi nucleici non bersaglio. La reazione procede per 20-30 minuti a 4 °C.Il passo successivo è l'elettroforesi. Viene utilizzato un tampone di bassa forza ionica e un pH simile a quello utilizzato nella reazione di legame. Produce un "effetto gabbia" che stabilizza i complessi, aumenta la mobilità e riduce la generazione di calore. Dopo l'elettroforesi, i componenti del gel vengono trasferiti su carta da filtro. In una stanza buia, la carta da filtro viene quindi esposta alla pellicola. Se la proteina si lega alla sonda, due distinte regioni marcate saranno visibili nel trasferimento. Uno che rappresenta il complesso e uno separato che rappresenta la sonda non legata. La separazione dimostra che la proteina si è legata con successo all'acido nucleico. Ora che abbiamo visto la procedura di base, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni. La cromatina è il complesso strettamente impacchettato di DNA e proteine che si trovano nelle cellule eucariotiche. Gli enzimi che rimodellano la cromatina modificano la struttura per aprire il DNA alla trascrizione. Poiché ciò modifica la mobilità del complesso, l'EMSA può essere utilizzato per esplorare l'attività di legame dell'enzima. Un approccio alternativo alla marcatura sfrutta l'interazione tra il DNA e l'enzima metiltransferasi. Un cofattore può essere modificato per legarsi in modo permanente al DNA tramite metiltransferasi. Piuttosto che marcare con il fosforo-32, il cofattore è coniugato alla biotina, il che è vantaggioso perché non è radioattivo. Poiché il cofattore è sito-specifico nel suo attaccamento, è rilevante per la genotipizzazione, il rilevamento della metilazione e la consegna genica. Gli acidi nucleici biotinilati vengono rilevati attraverso la fluorescenza ultravioletta. Quando gli stimoli ambientali attivano le istidina chinasi, un ?regolatore della risposta? è fosforilato. Questo a sua volta si lega al DNA, influenzando la trascrizione, che può essere studiata dall'EMSA. Ad esempio, un regolatore di risposta in? È stato dimostrato che il desulfovibrio vulgaris si lega al gene di interesse. L'EMSA è stato utilizzato per verificare che il vincolo avesse avuto luogo. Hai appena visto il video di JoVE sul test di spostamento della mobilità elettroforetica. A questo punto è necessario comprendere i principi di funzionamento, le fasi della procedura e i principali parametri operativi. Grazie per l'attenzione!

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detecting protein-dna binding by emsa

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein.

EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed with the test protein, and any binding changes the size and shape of the complex.

The bound and unbound molecules are then separated by gel electrophoresis. An electric field pulls macromolecules through a gel matrix. They separate by mass, charge, and conformation. Protein-DNA complexes move differently from free probe, so the shifted band shows that binding occurred. A supershift assay can also confirm the protein’s identity. In that step, an antibody with known affinity binds the protein and shifts the complex even further.

The lab procedure begins by isolating the protein. Molecular biology methods are used to express the protein in cells and then purify it. The nucleic acid is amplified and labeled to form the probe. Because phosphorus-32 is radioactive, a radiation-safe workbench and protective equipment are required during labeling.

The gel must be non-denaturing so the protein does not change conformation or fall off the probe during electrophoresis. Polyacrylamide gels have pore sizes of about 5 to 20 nm and are used for short probes up to 100 base pairs long. Agarose gels have larger pores, about 70 to 700 nm, and are used for larger probes. After the protein and probe are ready, they are mixed in TRIS buffer for binding.

The binding reaction uses a pH close to physiological conditions. The salt concentration must be high enough to reduce weak, non-target binding. The reaction runs for 20 to 30 min at 4 °C. Electrophoresis is then done in a buffer with low ionic strength and a similar pH. This creates a caging effect that helps stabilize complexes, increases mobility, and reduces heat generation.

After the gel runs, the components are transferred onto filter paper. The paper is exposed to film in a dark room. If binding occurred, two labeled regions appear: one for the protein-nucleic acid complex and one for the unbound probe. That separation shows the protein successfully bound the nucleic acid.

EMSA is useful in several research areas. Chromatin-remodeling enzymes can be studied because they change chromatin structure and affect DNA mobility. A modified EMSA can use biotinylated nucleic acids instead of radioactive labels. This approach is site-specific and useful for genotyping, methylation detection, and gene delivery. It is also detected through ultraviolet fluorescence.

The assay can also help study bacterial response regulators. When environmental stimuli activate histidine kinases, a response regulator becomes phosphorylated and binds DNA to affect transcription. The transcript gives an example from Desulfovibrio vulgaris, where EMSA was used to confirm binding to a gene of interest. EMSA therefore provides a sensitive way to study protein-nucleic acid interactions and their role in DNA replication, transcription, repair, and RNA processing.

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

Questa collezione descrive i metodi di purificazione più comunemente utilizzati, come la cromatografia per affinità, così come i metodi analitici, come il MALDI-TOF. Inoltre, i video mostrano i metodi per valutare l'interazione e la funzione delle biomolecole, quali la co-immunoprecipitazione e l'etichettatura metabolica.

Learn how EMSA detects protein-DNA binding with labeled probes, gel electrophoresis, and band shifts. See the steps and common applications.

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA | JoVE K12

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Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

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Inheritance and Variation of Traits

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Overview

Principles of EMSA

Protein and Gel Preparation

Binding, Electrophoresis, and Detection

Applications

Summary

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

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Cell Structure

Background
Cells represent the most basic biological units of all organisms, whether it be simple, single-celled organisms like bacteria, or large, ...

Visualizing Onion and Cheek Cells
ExpandImmediately before the experiment, wash and peel onion bulbs for the class.
Remove the entire brown outer skin and ...

Visualizing Onion and Human Cells
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What are Cells?

Cell Diversity

The concept of a cell started with microscopic observations of dead cork tissue by Robert Hooke in 1665. Hooke coined the term &#34;cell&#34; based on the ...

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Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Polymerase chain reaction (PCR) is ...

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Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells.

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

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