Why is SDS used in the DNA isolation lysis buffer?

SDS is a strong anionic detergent that breaks apart cell membranes, allowing cells to lyse and release their DNA. The experiment compares DNA yield from samples prepared with and without SDS to demonstrate how detergent enhances cell membrane disruption and DNA recovery from cheek cells.

What is the purpose of proteinase K in DNA isolation?

Proteinase K is an enzyme that digests proteins associated with DNA, including histones and other cellular proteins. Adding proteinase K and incubating samples at 56°C for 10 minutes helps purify the DNA by removing protein contaminants that would otherwise interfere with downstream analysis.

How does ethanol precipitation isolate DNA from solution?

Ethanol is a nonpolar solvent that causes DNA to become insoluble and precipitate out of the aqueous solution. When 100% ethanol is carefully layered over the cell lysate, stringy DNA precipitate forms at the interface between the ethanol and aqueous layers, allowing visual isolation and collection of the DNA.

What does a restriction enzyme digest reveal about DNA structure?

Restriction enzymes cut DNA at specific recognition sequences, producing fragments of predictable sizes. By comparing virtual digests to actual gel results, students can verify enzyme specificity and understand how restriction enzyme analysis identifies DNA sequences and creates unique banding patterns for DNA profiling.

Why are different buffers required for different restriction enzymes?

Restriction enzymes have optimal pH and salt conditions for catalytic activity. StuI works optimally in buffer 2.1 or CS buffer, while BsrGI performs best in buffer 2.1 or buffer 3.1. Using the correct buffer ensures maximum enzyme efficiency and accurate DNA digestion results during restriction enzyme analysis.

How does gel electrophoresis separate DNA fragments by size?

DNA fragments migrate through an agarose gel matrix when an electric current is applied, with smaller fragments moving faster toward the positive electrode than larger ones. After staining with SYBR Safe dye and UV visualization, distinct bands appear representing DNA fragments of different sizes, allowing comparison between single and double enzyme digests.

What does combining two restriction enzymes in a single digest demonstrate?

Using both StuI and BsrGI together produces more DNA fragments than either enzyme alone, demonstrating additive cutting at different recognition sites. The virtual digest with both enzymes yields 12 bands compared to 7 for StuI and 6 for BsrGI, illustrating how multiple restriction sites create unique DNA profiles for identification purposes.

Analisi degli enzimi di isolamento e restrizione del DNA

Concetti Preparazione dell'istruttore Protocollo per Studenti

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L'estrazione del DNA è la rimozione e la purificazione del DNA dalle cellule. In primo luogo, le cellule vengono lisate - aperte - di solito attraverso una combinazione di distruzione fisica e trattamento con sostanze chimiche, come un detergente che dissolve la cellula e le membrane nucleari. SDS o sodio dodecil solfato è un detergente di uso comune che agisce solubilizzando le proteine e i lipidi che compongono queste membrane. Il contenuto può quindi fluttuare liberamente nella soluzione circostante.

Successivamente, il DNA deve essere separato dalle altre molecole presenti. La proteinasi K aggiunta alla reazione rompe i legami peptidici e digerisce le proteine contaminanti. Il sale viene quindi aggiunto al campione, che stabilizza i gruppi fosfato caricati negativamente nella spina dorsale del DNA e, dopo l'aggiunta di alcol ghiacciato, fa precipitare il DNA fuori dalla soluzione. Il precipitato bianco viene raccolto facendolo girare in una centrifuga dove si deposita sul fondo del tubo. Dopo averlo lavato e risospeso in una soluzione tampone, il DNA estratto può finalmente essere utilizzato in applicazioni di ricerca o biotecnologiche.

Alcune applicazioni biotecnologiche, come l'impronta digitale del DNA, che possono identificare nuovi modelli nel DNA specifici di uno o più individui, comportano l'uso di enzimi di restrizione. Gli enzimi di restrizione sono molecole che interagiscono con il DNA e riconoscono sequenze specifiche. Una volta identificato il loro sito specifico, tagliano il DNA. Ciò comporterà il taglio del filo in uno o più pezzi lineari. Se il DNA estratto era un plasmide, un pezzo circolare di DNA che si trova più spesso nei batteri, qualsiasi taglio comporterà la formazione di uno o più frammenti lineari da parte del DNA. Diversi enzimi di restrizione riconoscono diverse sequenze di DNA, quindi l'utilizzo di una combinazione di questi può portare alla produzione di frammenti distinti.

Nel DNA fingerprinting, possiamo quindi esaminare questi frammenti utilizzando una tecnica chiamata elettroforesi del DNA o gel. Per preparare i gel, l'agarosio in polvere viene mescolato con un tampone e riscaldato fino a quando non si scioglie. Una colorazione nucleotidica viene quindi aggiunta alla miscela calda e quindi questa soluzione viene versata nello stampo di colata. Viene inserito un pettine per formare i pozzetti. Una volta solidificato, il gel viene trasferito in una scatola di gel riempita di tampone e il pettine viene rimosso. Una miscela di riferimento di frammenti di DNA colorato di lunghezze note, la scala del DNA, viene aggiunta a un pozzetto e i campioni di DNA colorato di interesse vengono caricati nei pozzetti rimanenti. La scatola è collegata a una fonte di alimentazione e l'accensione induce la migrazione dei gruppi fosfato caricati negativamente nei nucleotidi del DNA attraverso il gel verso l'anodo, l'estremità positiva. I pezzi più piccoli si muovono più rapidamente dei frammenti più grandi, che migrano con difficoltà.

Al termine della corsa, il gel viene esposto alla luce ultravioletta per visualizzare la colorazione nucleotidica nei campioni di DNA. La loro presenza può essere confermata in base alla loro posizione relativa alle fasce ladder. Poiché il DNA con sequenze diverse avrà siti di taglio in posizioni diverse, questo può produrre nuovi modelli di bande, o impronte digitali, che possono essere utilizzati per distinguere individui o profili di DNA varianti.

In questo laboratorio eseguirai estrazioni di DNA utilizzando un tampone con e senza SDS per valutare l'importanza dei detergenti nell'isolamento del DNA e quindi digerirai il DNA plasmidico con diversi enzimi di restrizione per esaminare i profili di DNA risultanti.

Print Procedure Steps

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Isolamento del DNA
- NOTA: In questo esperimento eseguirai l'isolamento del DNA in due condizioni sperimentali: una utilizzando un tampone contenente il detergente SDS e una senza detersivo. Ipotesi: L'ipotesi alternativa per questo esperimento potrebbe essere che il campione preparato senza SDS, un potente detergente anionico che rompe le membrane cellulari, produrrà meno DNA rispetto al campione preparato con SDS. L'ipotesi nulla per questo esperimento potrebbe essere che entrambi i campioni produrranno una quantità uguale di DNA.
- Per iniziare, raccogli un campione di tessuto per l'isolamento del DNA. Qui utilizzerai le tue cellule delle guance. Usa un bastoncino di ghiacciolo per raschiare l'interno delle guance per circa 30 s. IMPORTANTE: Non raschiare abbastanza forte da causare dolore o far uscire sangue.
- Posiziona un imbuto in una provetta conica da 15 ml.
- Quindi prendi 10 ml della soluzione salina all'1% che ti viene fornita in una tazza etichettata e agitala in bocca senza deglutire.
- Continua a frusciare per 90 s e poi sputa la soluzione salina contenente le cellule della guancia nell'imbuto per raccoglierla nel tubo conico.
- Successivamente, etichetta due provette per microcentrifuga vuote con le tue iniziali.
- Etichetta una delle provette come +SDS e l'altra come -SDS per differenziare i due trattamenti.
- Quindi aggiungi da 1,5 a 2 ml della soluzione salina contenente le cellule della guancia a ciascuna provetta.
- Centrifuga le provette in una microcentrifuga per 30 s.
- Rimuovi le provette dalla microcentrifuga e versa con cura il surnatante senza disturbare le cellule raccolte sul fondo di ogni provetta.
- Riempi le provette con più soluzione salina contenente le cellule della guancia e ripeti la centrifugazione.
- Ripeti questo processo facendo attenzione a distribuire uniformemente le cellule tra le provette +SDS e -SDS fino a quando tutte le cellule della guancia sono state raccolte.
- Quindi, aggiungere 1 mL di tampone di lisi contenente SDS alla provetta contrassegnata come +SDS, quindi risospendere il pellet cellulare pipettando su e giù.
- Quindi aggiungere 1 mL di tampone di lisi senza SDS alla provetta contrassegnata con -SDS e risospendere il pellet cellulare pipettando su e giù.
- Dopodiché, aggiungere 10 μL di proteinasi K a ciascuna provetta e poi posizionare con cura le provette nel bagno d'acqua a 56 ºC per 10 minuti.
- Dopo 10 minuti, rimuovi con cautela le provette dal bagno d'acqua e aggiungi 100 μL di NaCl 2,5 M a ciascuna provetta.
- Chiudi saldamente le provette e capovolgi più volte per mescolare.
- Quindi, etichetta una provetta conica da 15 ml come +SDS e un'altra con -SDS.
- Versa il contenuto di ogni provetta per microcentrifuga nella corrispondente provetta conica da 15 ml.
- Ottieni un'aliquota da 10 ml di etanolo al 100% dal congelatore.
- Tieni una delle provette coniche inclinata e dispensa lentamente 1 ml di etanolo al 100% nella provetta per formare uno strato sopra il liquido già presente nella provetta.
- Ripeti questo processo per il secondo tubo conico.
- Ora guarda entrambi i tuoi tubi. Dovrebbe esserci un precipitato filamentoso presente all'interfaccia dell'etanolo e dello strato acquoso sottostante. Questo materiale filamentoso contiene il DNA isolato. Scatta foto del DNA nel tubo e prendi note descrittive chiare e disegni delle tue osservazioni sul tuo taccuino.
- Utilizzando un'asta di vetro, raccogli il DNA dal tubo +SDS ed esaminalo. Ripeti l'operazione per il tubo -SDS, registrando nuovamente le tue osservazioni. Prendi nota se uno dei tubi sembra avere più precipitato dell'altro e perché potrebbe essere così.
- Infine, getta tutti i rifiuti liquidi nell'apposito contenitore e rimetti tutti gli strumenti nelle loro posizioni corrette nel laboratorio.
Enzima di restrizione Virtual Digest
- Per studiare come funzionano gli enzimi di restrizione, prima vai al sito web di New England Biolabs: https://www.neb.com/
- Le risorse disponibili in questo sito consentono ai ricercatori di eseguire esperimenti virtuali prima che vengano eseguiti in laboratorio. Fare clic su "Strumenti e risorse" per trovare lo strumento NEBcutter e aprire il programma.
- A destra della casella di ricerca trova l'elenco che dice "Virale + fago". Da questo elenco, seleziona Lambda. Questo è il nome del DNA che stai per digerire. Seleziona l'opzione Lineare in cui lo strumento dice "la sequenza è" e l'opzione "Enzimi NEB" in cui lo strumento dice "Enzimi da usare". Quindi fare clic su Invia.
- La pagina successiva mostrerà una mappa di restrizione completa del DNA lambda. Questa mappa di restrizione può essere utilizzata per prevedere cosa accadrà se vengono utilizzati determinati enzimi. Quindi, fai clic su "Digest personalizzato" sotto l'intestazione "Opzioni principali".
- Cerca l'enzima StuI e nota che funziona in modo ottimale nel buffer 2.1 o nel buffer CS. Seleziona l'enzima StuI e fai clic su digest.
- Nella finestra successiva clicca su "Visualizza gel" sotto l'intestazione "Opzioni principali". Selezionare l'opzione per eseguire un gel virtuale all'1% utilizzando un digest pBR322-BstN1.
- Dopo che i risultati sono apparsi, fai uno screenshot e incollalo in un documento vuoto.
- Dopodiché, torna alla pagina principale dello strumento NEBcutter e seleziona "Nuovo digest personalizzato".
- Questa volta cerca l'enzima BsrGI e nota che si comporta in modo ottimale nel buffer 2.1 o nel buffer 3.1. Seleziona l'enzima e fai clic su digest.
- Sotto l'intestazione Opzioni principali fai clic su "Visualizza gel" e seleziona le opzioni per eseguire un gel virtuale all'1% utilizzando un digest pBR322-BstN1.
- Fai uno screenshot dei risultati e salvalo in un documento di testo.
- Infine, ripeti questi passaggi utilizzando sia StuI che BsrGI insieme in un unico digest.
- Ancora una volta, fai uno screenshot e salva il gel risultante.
DNA
- Prima di iniziare i digest dell'enzima di restrizione, metti prima le tue aliquote di DNA lambda, tampone NEB 2.1, enzima StuI ed enzima BsrGI in un secchiello del ghiaccio e portalo nella tua area di lavoro.
- Etichetta una provetta come StuI - questo conterrà il digest StuI.
- Etichetta una provetta come BsrGI per contenere il digest BsrGI.
- Allora, etichetta una provetta S+B, per contenere il digestato con entrambi gli enzimi.
- Usa i micropipettatori appropriati per impostare le reazioni elencate nella Tabella 1:Clicca qui per scaricare la Tabella 1
- Per prima cosa, pipetta i 40 μL di acqua in ogni provetta.
- Quindi, utilizzando ogni volta un puntale per pipetta nuovo, erogare 5 μL di tampone 2.1 in ciascuna provetta e pipettare su e giù per mescolare.
- Quindi, aggiungi 4 μL di DNA lambda a ciascuna provetta, quindi pipetta 0,5 μL di ciascun enzima nelle provette appropriate.
- Infine, aggiungi una quantità sufficiente di acqua a ciascuna provetta per portare il volume totale fino a 50 μL.
- Successivamente, incubare le provette a 37 ºC per 15 - 60 minuti a bagnomaria e rimettere i tamponi e gli enzimi nel congelatore.
- Per preparare un gel di agarosio per eseguire il digest, in un pallone da 250 ml mescolare 1 g di polvere di agarosio con 100 ml di tampone TAE.
- Microonde la soluzione per circa 90 s a piena potenza, facendo attenzione a evitare che la soluzione trabocchi.
- Quindi, rimuovi con cura la soluzione dal microonde usando un guanto o un termoforo e mettila a raffreddare per circa 15 minuti.
- Mentre la soluzione di agarosio si raffredda, prepara un vassoio di colata.
- Quando la soluzione di agarosio è fredda, aggiungi 5 μL di colorante gel sicuro 10,000X SYBR alla soluzione.
- Aggiungi il pettine che viene utilizzato per fare i pozzetti del gel al vassoio di colata dell'apparecchio per elettroforesi su gel.
- Versa la soluzione di gel di agarosio nel vassoio di colata e lasciala solidificare.
- Una volta che il gel è solido, tira il pettine verso l'alto per rimuoverlo dal gel, e poi rimuovi le dighe dal vassoio di colata, se appropriato.
- Posiziona il gel nella camera di elettroforesi con i pozzetti posizionati più vicino all'elettrodo negativo o nero e riempi la camera con 1x tampone TAE per coprire completamente il gel.
- Rimuovi i tuoi campioni dal bagno d'acqua.
- Quindi aggiungi 8,3 μL di colorante di caricamento 6X a ciascun campione.
- Dispensa 10 μL del digestato pBR322-BstN1 che contiene frammenti di DNA di dimensioni note nel primo pozzetto.
- Quindi carica 25 μL di campione StuI nel secondo pozzetto.
- Metti 25 μL di campione BsRGI nel terzo pozzetto.
- Carica 25 μL di campione S+B nel quarto pozzetto.
- Per far funzionare il gel, collegare i cavi nella camera di elettroforesi e poi nell'alimentatore. Il piombo positivo rosso dovrebbe trovarsi all'estremità più lontana dai pozzetti e il piombo negativo nero dovrebbe essere il più vicino ai pozzi. Questo perché i campioni passeranno da negativi a positivi.
- Accendi l'alimentatore e imposta la scatola del gel in modo che funzioni a 170 volt per circa 60 minuti.
- Al termine della corsa, spegni l'alimentazione alla scatola di gel e scollega gli elettrodi dal serbatoio.
- Quindi rimuovi il gel dalla camera di elettroforesi e osservalo con un transilluminatore UV. ATTENZIONE: Proteggere gli occhi dai raggi UV indossando occhiali protettivi o utilizzando la visiera in dotazione.
- Infine, usa la fotocamera di un cellulare per scattare una foto del gel direttamente dall'alto e parallelamente alla superficie del gel.
Risultati
- Confronta il gel che hai eseguito in laboratorio con il tuo digest enzimatico virtuale con StuI.
- Il digest virtuale con StuI ha portato a sette bande. Conta le bande nella corsia StuI del tuo gel e nota se questo corrispondeva al digest virtuale o sembrava mostrare uno schema simile. NOTA: Piccole bande sui gel per elettroforesi di agarosio sono spesso invisibili.
- Ora guarda i risultati per il tuo digest BsrGI. Il digest virtuale con BsrGI ha portato a sei bande. Conta le bande nella corsia BsrGI. Anche in questo caso, si noti se il digest virtuale e il digest di laboratorio hanno mostrato lo stesso modello o un modello simile.
- Infine, guarda il digest virtuale con StuI e BsrGI. Il digest virtuale con entrambi gli enzimi ha portato a 12 bande. Conta le bande nella corsia corrispondente del tuo gel e considera se il modello di bande del DNA sembra simile al digest virtuale.