What is the purpose of the sand layer in column chromatography?

The sand layer, placed 0.5 cm above the cotton plug, prevents silica gel from passing through the plug into your collected fractions. This protective barrier ensures that only the separated dyes are collected in pure fractions, maintaining the integrity of your samples throughout the separation process.

Why does column chromatography use two different eluents for separating food dyes?

Using ethanol first elutes erioglaucine, which has lower affinity for silica gel, while water elutes tartrazine more effectively due to its higher polarity. This two-solvent approach saves time and minimizes solvent waste while maintaining fraction purity, compared to using a single eluent throughout the entire separation.

How do you prepare the silica gel slurry for column chromatography?

Weigh 5 grams of silica gel powder and mix it with 18 mL of 95% ethanol in a beaker. Stir with a glass rod until the texture is consistent and resembles batter with no dry patches or clumps. The slurry should flow easily to avoid clogging the funnel or trapping air bubbles in the column.

What flow rate should you maintain when eluting dyes through the column?

Adjust the stopcock so the solvent level decreases approximately 1 mL every 15 to 20 seconds. Maintain at least 1 cm of solvent above the silica gel at all times by periodically refilling the column. This controlled solvent flow rate ensures proper separation and prevents band broadening during the elution process.

How do you apply the green food dye to the silica gel column?

Use a clean pipette to gently apply 5 to 7 drops of the dye solution evenly across the top of the silica gel. If necessary, add a few drops of ethanol to keep the silica gel covered. Allow the dye to soak in before beginning the elution process with your chosen eluent.

What do the different colors of fractions tell you about dye affinity for silica gel?

The blue erioglaucine elutes with ethanol, indicating lower affinity for silica gel, while yellow tartrazine requires water, indicating higher affinity. This separation demonstrates that tartrazine binds more strongly to silica gel than erioglaucine does, which is why different solvents are needed to elute each dye effectively.

Why is it important to avoid stopping the column chromatography for extended periods?

Stopping for more than 1 minute at a time causes compound bands to start broadening, which reduces separation quality and makes it harder to collect pure fractions. Continuous flow maintains sharp band definition and ensures efficient separation of the dyes throughout the elution process.

Cromatografia su colonna

Concetti Preparazione dell'istruttore Protocollo per Studenti

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La cromatografia su colonna è una tecnica che utilizza una colonna impaccata per separare i composti in base alle loro interazioni con una fase stazionaria, che di solito è sotto forma di microsfere microscopiche. Gli spazi tra le perle sono riempiti con solvente. L'apertura della colonna consente al solvente di fluire attraverso la fase stazionaria. Quando una miscela viene applicata alla sommità della colonna impaccata seguita da una maggiore quantità di solvente, la miscela passa alla fase mobile e scorre attraverso la fase stazionaria.

Ogni componente della miscela interagisce con la fase stazionaria in modo diverso. Alcuni componenti hanno interazioni deboli con la fase stazionaria e quindi si muovono rapidamente attraverso la colonna, mentre altri hanno forti interazioni con la fase stazionaria e quindi si muovono più lentamente. Questo separa i diversi composti in bande, che vengono raccolte in piccole frazioni. Ciò consente la purificazione di ogni composto.

Quindi, che tipo di proprietà possono essere utilizzate per separare le miscele? Una delle proprietà più comunemente usate è la polarità. Per questo, il gel di silice, che è una forma di biossido di silicio, viene spesso utilizzato come fase stazionaria. Il gel di silice interagisce con i composti mediante interazioni dipolo-dipolo e legami idrogeno attraverso i gruppi -OH che si formano sulla sua superficie. Pertanto, i composti polari interagiranno fortemente con la fase stazionaria, mentre i composti non polari interagiranno debolmente.

Altre proprietà che possono essere sfruttate per la separazione includono le dimensioni, la carica e l'idrofobicità. Un modo comune per caricare la fase stazionaria nella colonna è come un impasto di fase stazionaria e solvente. Quindi, la fase stazionaria viene impacchettata facendo scorrere più solvente attraverso la colonna per compattare il liquame. È essenziale che la fase stazionaria sia impacchettata in modo uniforme senza bolle d'aria, canali vuoti o zone secche. Questi possono interrompere il flusso e causare la miscelazione delle bande.

Nella scelta di una colonna, il diametro si basa sul volume del campione da separare. Il campione dovrebbe coprire la parte superiore della colonna in uno strato sottile e uniforme. Uno strato di campione più spesso porta a bande più ampie. La lunghezza della colonna dipende da quanto bene i composti si separano nella fase stazionaria. I composti con affinità simili per la fase stazionaria richiedono una lunga colonna per un'adeguata separazione. Tuttavia, una miscela di composti con affinità molto diverse per la fase stazionaria può essere separata su una colonna più corta.

In questo laboratorio, esplorerai la cromatografia su colonna impacchettando e preparando prima una colonna di gel di silice. Quindi, utilizzerai la tua colonna per separare i componenti colorati nel colorante alimentare verde.

Print Procedure Steps

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonte: Lara Al Hariri e Ahmed Basabrain presso l'Università del Massachusetts Amherst, MA, USA

Cromatografia su colonna del colorante alimentare
In questo esperimento, utilizzerai la cromatografia su colonna per separare il colorante alimentare verde nei coloranti blu e gialli che lo compongono, chiamati erioglaucina e tartrazina. Innanzitutto, utilizzerai il 95% di etanolo per eluire il colorante con un'affinità più debole per il gel di silice. Quindi, sciacquierai il secondo colorante dalla colonna con acqua. Per recuperare i coloranti purificati, raccoglierai ogni striscia di colorante man mano che lascia la colonna. Questi volumi raccolti sono chiamati frazioni.
- Per iniziare, indossa un camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e un paio di guanti in nitrile.
- Porta una colonna o una buretta nell'area di rifornimento centrale. Prendi un pezzo di cotone o lana di vetro e premilo nella parte superiore della colonna. Utilizzare un filo o un'asta lunga e smussata per spingerlo verso il basso per tappare la colonna appena sopra il rubinetto. nota: Il cotone deve essere stabile, ma non impacchettarlo troppo densamente, perché il solvente deve attraversarlo facilmente. Assicurarsi che il rubinetto possa girare liberamente senza impigliarsi nella spina.
- Attacca un morsetto per buretta a un supporto da laboratorio e blocca la colonna in posizione verticale con circa 4 pollici di spazio sotto di essa. Assicurarsi che il rubinetto sia chiuso.
- Etichetta un becher da 100 ml come 'rifiuto' e posizionalo sotto la colonna.
- Successivamente, misura 1 g di sabbia in una barca di pesatura tarata e riportala al banco.
- Allora, segna la colonna circa 0,5 cm sopra la parte superiore del tappo di cotone.
- Posiziona un piccolo imbuto in cima alla colonna e versa abbastanza sabbia attraverso l'imbuto in modo che ci sia uno strato profondo 0,5 cm sopra il tappo. Ciò impedirà al gel di silice di passare attraverso il tappo nelle frazioni.
- Rimuovi l'imbuto e picchietta delicatamente la colonna per distribuire uniformemente la sabbia.
- Ora, prepara i tuoi eluenti. Etichettare un becher da 50 ml e un cilindro graduato da 50 ml come "acqua".
- Misura 50 ml di acqua deionizzata con il cilindro graduato e versala nel becher.
- Allora, etichetta un altro becher da 50 ml e un cilindro graduato da 50 ml come 'etanolo'. Misurare 50 ml di etanolo al 95% e versarlo in questo becher.
- Ora, procurati 4 o 5 pipette Pasteur pulite e un bulbo per pipette. Pipettare delicatamente 7 – 8 mL di etanolo lungo le pareti interne della colonna. Questo strato di solvente ti permetterà di versare questo impasto di gel di silice nella colonna senza disturbare la sabbia.
- Apri il rubinetto e scarica ~1 mL di etanolo nel becher di scarico per eliminare l'aria dal rubinetto e per confermare che il solvente scorre facilmente attraverso il tappo. Assicurarsi che non ci siano macchie secche nella sabbia e nel tappo e picchiettare delicatamente il lato della colonna per rimuovere le bolle d'aria intrappolate.
- Successivamente, posiziona un imbuto pulito nella parte superiore della colonna ed etichetta un terzo becher da 50 ml 'slurry gel di silice in etanolo'.
- Pesa attentamente 5 g di polvere di gel di silice e versala nel tuo becher etichettato.
- Allora, porta il gel di silice, una bacchetta di vetro e il tuo cilindro graduato di etanolo alla cappa di erogazione dell'etanolo.
- Misura 18 ml di etanolo al 95% e versalo nel becher. Mescola il composto con la bacchetta di vetro fino a quando la consistenza non è consistente e non rimangono macchie secche o grumi di polvere. Questo di solito richiede ~1 minuto. Nota: l'impasto dovrebbe essere denso, come la pastella, ma dovrebbe comunque fluire facilmente. Se il liquame è troppo rigido, potrebbe ostruire l'imbuto o intrappolare bolle d'aria nella colonna.
- Una volta che la polvere è completamente sospesa nell'etanolo, portala sul tuo banco. Mescolare l'impasto fino a quando la sua consistenza non sarà di nuovo consistente e versarlo immediatamente nella colonna.
- Picchietta delicatamente i lati della colonna mentre il gel di silice si deposita per eliminare le bolle d'aria.
- Risciacqua il becher con 1 o 2 ml di etanolo e versa il risciacquo nella colonna. Quindi, togliete l'imbuto e mettetelo da parte.
- Pipetta l'etanolo lungo l'interno della colonna per lavare via le particelle attaccate alle pareti. Quindi, scolare il solvente fino a quando il menisco non si trova appena sopra la parte superiore del gel di silice.
- Ora, usa un cilindro graduato da 5 o 10 ml per ottenere circa 0,8 ml della soluzione di colorante alimentare verde.
- Usa una pipetta pulita per applicare delicatamente da 5 a 7 gocce della soluzione colorante in modo uniforme sulla parte superiore del gel di silice. Se necessario, aggiungere qualche goccia di etanolo per mantenere coperto il gel di silice.
- Mentre aspetti che il colorante si assorba, etichetta due becher puliti da 50 ml come 'frazione di etanolo' e 'frazione dell'acqua'. Sostituire il becher di scarto sotto la colonna con il becher della frazione di etanolo.
- Successivamente, riempi la colonna con etanolo, pipettando il primo mL lungo le pareti interne per evitare di disturbare il gel di silice.
- Allora, apri parzialmente il rubinetto e regolalo fino a quando il livello del solvente diminuisce ~1 mL ogni 15 – 20 s.
- Riempi periodicamente la colonna per mantenere il flusso di etanolo. Assicurati che ci sia sempre almeno 1 cm di solvente sopra il gel di silice.
- Monitora le bande gialle e blu mentre si separano. nota: Se hai bisogno di allontanarti, chiudi il rubinetto in modo che la colonna non si asciughi mentre sei via. Evita di fermarti per più di 1 minuto alla volta perché le bande composte inizieranno ad allargarsi. Di solito ci vogliono circa 20-35 minuti prima che il colorante che si muove più velocemente lasci la colonna.
- Una volta che hai raccolto tutto il colorante che si muove più velocemente nel becher della frazione di etanolo, chiudi il rubinetto, metti da parte la frazione di etanolo e metti il becher di scarto sotto la colonna.
- Drena il solvente fino a quando il menisco non si trova appena sopra la parte superiore del gel di silice. Quindi, sostituire il becher di scarto con il becher della frazione acquosa.
- Usa una pipetta pulita per riempire la parte superiore della colonna con acqua deionizzata. Quindi, aprire il rubinetto quel tanto che basta per far fluire l'acqua attraverso la colonna a una velocità di circa 1 ml ogni 15 – 20 s.
- Riempi la colonna con acqua se necessario fino a quando la seconda banda di colore non ha completamente lasciato la colonna. Questo di solito richiede altri 15-25 minuti. Quindi, chiudere il rubinetto e sostituire il becher della frazione d'acqua con il becher dei rifiuti.
- Ora, svuota completamente la colonna e lascia il rubinetto aperto.
- Registra i colori delle frazioni di etanolo e acqua nel tuo quaderno di laboratorio.
  Tabella 1: Cromatografia su colonna di colorante alimentare
  
  Colore Volume (mL)
  Frazione di etanolo
  Frazione acquosa
  Clicca qui per scaricare la Tabella 1
- Versa le frazioni nei corrispondenti cilindri graduati da 50 ml e registra il volume di ogni frazione. Quindi, chiudere il rubinetto e portare la colonna su una cappa aspirante.
- Blocca la colonna in posizione verticale nel cofano in modo che il gel di silice possa asciugarsi. Il tuo istruttore ti dirà come pulire la colonna o se ne occuperà dopo il laboratorio.
- Ora, butta le frazioni raccolte e l'etanolo, l'acqua e la soluzione colorante avanzati nello scarico e pulisci il resto della tua vetreria come al solito.
- Scarta le pipette Pasteur usate nei rifiuti di vetro. Getta i tovaglioli di carta usati e la barca per pesare nella spazzatura del laboratorio e pulisci il piano di lavoro prima di partire.
Risultati
In questo esperimento, si è visto che l'etanolo ha eluito l'erioglaucina blu in modo tempestivo, ma non era un eluente efficace per la tartrazina gialla. La cromatografia su carta del colorante verde mostra risultati simili. Pertanto, concludiamo che l'erioglaucina ha un'affinità inferiore per il gel di silice rispetto alla tartrazina.

Ora, considera i vantaggi dell'utilizzo di due solventi per eluire il colorante separatamente. L'acqua è più polare dell'etanolo, quindi supponiamo che eluisca entrambi i coloranti più velocemente di quanto farebbe il solo etanolo. Anche se in generale si sarebbe usato meno solvente se si fosse usata solo acqua, la separazione sarebbe stata peggiore, rendendo più difficile la raccolta delle frazioni pure.

In alternativa, avresti potuto continuare a usare l'etanolo dopo aver raccolto l'erioglaucina, ma ci sarebbe voluto molto tempo e molto etanolo per eluire la tartrazina in quel modo. Il passaggio dell'eluente in acqua dopo l'eluizione dell'erioglaucina ha consentito di risparmiare tempo e ridurre al minimo lo spreco di solvente senza sacrificare la purezza.