Spettroscopia UV-Vis dei coloranti

Fonte: Lara Al Hariri e Ahmed Basabrain presso l'Università del Massachusetts Amherst, MA, USA

1. Confronto lunghezza d'onda dell'assorbanzaExpand

   Nella prima parte del laboratorio, utilizzerai la spettroscopia di assorbimento della luce ultravioletta e visibile, o spettroscopia di assorbimento UV-Vis, per analizzare le caratteristiche di assorbimento della fluoresceina, del β-carotene e del colorante indaco. Per eseguire la spettroscopia UV-Vis, è necessario posizionare una soluzione tra una sorgente luminosa e un fotorivelatore. Le molecole assorbiranno la luce a lunghezze d'onda che corrispondono alle energie necessarie per eccitare i loro elettroni e disperderanno o trasmetteranno il resto.

   Uno spettro di assorbimento rappresenta la variazione del numero di fotoni di ciascuna lunghezza d'onda che raggiungono il rivelatore. Un'assorbanza più elevata corrisponde a un minor numero di fotoni rilevati di quella lunghezza d'onda. Prenderai prima uno spettro del solvente puro, che lo strumento sottrarrà dallo spettro della soluzione colorante per mostrarti solo i dati di assorbanza dal colorante. Questo riferimento è chiamato bianco solvente.

   • Prima di iniziare, indossa un camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti. nota: Le soluzioni di β-carotene e indaco utilizzano rispettivamente esano e dimetilformammide, quindi lavorerai con i coloranti in una cappa aspirante. DMF ed esano degradano i guanti sottili in nitrile, quindi cambia i guanti se ci metti del solvente.
   • Ora, procurati una cuvetta di quarzo pulita. Le cuvette hanno in genere due lati trasparenti e due lati strutturati o opachi. Tenere sempre la cuvetta per i lati testurizzati per mantenere puliti i lati trasparenti.
   • Per prima cosa, analizzerai una soluzione di fluoresceina in acqua. Per rendere il tuo solvente vuoto, riempi la tua cuvetta per circa 3/4 con acqua deionizzata.
   • Ora, pulisci i lati trasparenti della cuvetta con una salvietta da laboratorio. Controllare la cuvetta per bolle d'aria e picchiettare delicatamente la cuvetta per rimuoverle.
   • Allora, porta la cuvetta allo spettrometro. Apri la camera del campione dello spettrometro e pulisci la cuvetta un'ultima volta. Macchie e polvere possono assorbire o riflettere la luce, introducendo errori nei dati.
   • Ora, inserisci la cuvetta nel portacampioni in modo che i lati trasparenti siano in linea con la sorgente luminosa. Chiudere completamente lo sportello della camera del campione. Seguire le istruzioni del software dello spettrometro per impostare una scansione dell'assorbanza da 200 a 800 nm e scansionare la cuvetta come bianco del solvente.
   • Quando la scansione finisce, svuota la cuvetta e usa l'aria compressa per rimuovere grandi gocce d'acqua.
   • Quindi, portalo alla cappa condivisa e usa una pipetta Pasteur pulita per riempire la cuvetta per 3/4 della soluzione di fluoresceina da 3 μM fornita.
   • Controlla la cuvetta per le bolle d'aria e rimuovile se necessario prima di portare la cuvetta allo spettrometro. Ricordarsi di pulire i lati trasparenti un'ultima volta prima di posizionare la cuvetta nella camera del campione. Quindi, scansiona la cuvetta come campione.
   • Quando la scansione finisce, identifica le lunghezze d'onda assorbite dalla fluoresceina. La lunghezza d'onda con la più alta assorbanza è chiamata λ_max.
   • Registra le lunghezze d'onda dei picchi di assorbanza e l'intervallo di assorbimento complessivo nel tuo quaderno di laboratorio e poi salva i dati.

     Tabella 1: Assorbanza e λ_max dei coloranti

     	Intervallo di assorbanza (nm)	λmassimo (nm)
     fluoresceina
     β-carotene
     indaco

     Clicca qui per scaricare la Tabella 1
   • Ora, svuota la tua cuvetta nei rifiuti acquosi e sciacquala con acqua per rimuovere le tracce di fluoresceina.
   • Analizzerai il β-carotene dopo, quindi hai bisogno di un solvente esano. Sciacquare la cuvetta con esano alcune volte per rimuovere l'acqua residua prima di riempirla per 3/4 di esano puro.
   • Rimuovi le bolle d'aria, pulisci i lati della cuvetta e mettila nello spettrometro. Assicurarsi che la scansione sia impostata per un'assorbanza compresa tra 200 e 800 nm, quindi eseguire la scansione della cuvetta come un solvente vuoto.
   • Quando la scansione finisce, svuota la cuvetta nei rifiuti organici e asciugala con aria compressa.
   • Usa una pipetta pulita per riempire la cuvetta per 3/4 della soluzione di β-carotene da 3 μM fornita e torna allo spettrometro.
   • Pulisci i lati trasparenti della cuvetta, mettila nello spettrometro e scansionala come il tuo campione. Scrivi le lunghezze d'onda dei picchi nel tuo quaderno di laboratorio e salva i dati.
   • Ora, analizza il colorante indaco. La soluzione indaco è in DMF, quindi svuota la cuvetta nei rifiuti organici e risciacqua il β-carotene e l'esano rimanenti con DMF puro.
   • Riempi la cuvetta per 3/4 di DMF puro, mettila nello spettrometro e assicurati che le impostazioni di scansione siano le stesse di prima. Eseguire la scansione del solvente in bianco, quindi svuotare la cuvetta nei rifiuti organici e asciugarla con aria compressa.
   • Usa una pipetta pulita per riempire la cuvetta per 3/4 della soluzione di colorante indaco da 3 μM fornita e scansionala come campione. Annota le informazioni sull'assorbanza e salva i tuoi dati.
   • Infine, svuota la tua cuvetta nei rifiuti organici e sciacquala con acetone.
2. β-caroteneEspandi

   Nella seconda metà del laboratorio, utilizzerai la spettroscopia UV-Vis per correlare l'intensità dell'assorbanza e la concentrazione per il β-carotene misurando le assorbanze di 5 soluzioni di β-carotene con diverse concentrazioni. Ciò ti consentirà di creare una curva di calibrazione dell'assorbanza rispetto alla concentrazione di β-carotene e derivare l'equazione che descrive tale relazione.

   • Per iniziare, crea una tabella nel tuo quaderno di laboratorio con colonne per la concentrazione di β-carotene e l'assorbanza a 450 nm.

     Tabella 2: Assorbanza del β-carotene

     test	Concentrazione (μM)	Assorbanza a λmax (450 nm)
     1	1.9
     2	3.7
     3	7.5
     4	11
     5	15

     Clicca qui per scaricare la Tabella 2
   • Allora, prendi una cuvetta pulita e riempila per 3/4 di esano come il tuo solvente grezzo.
   • Rimuovi eventuali bolle d'aria, pulisci i lati trasparenti della cuvetta e mettila nello spettrometro. Impostare una scansione dell'assorbanza da 200 a 800 nm e scansionare la cuvetta come bianco del solvente.
   • Quando la scansione finisce, svuota la cuvetta nei rifiuti organici e asciugala con aria compressa.
   • Quindi, usa una pipetta pulita per riempire la cuvetta per 3/4 della soluzione di β-carotene da 1,9 μM, che è la soluzione con la concentrazione più bassa.
   • Pulisci i lati della cuvetta, inseriscila nello spettrometro e scansionala come campione.
   • Quando la scansione finisce, visualizza l'intensità di assorbanza del picco a 450 nm. Registratelo nel vostro quaderno di laboratorio come assorbanza per la soluzione da 1,9 μM.
   • Ora, svuota la cuvetta nei rifiuti organici, sciacquala con esano e asciugala con aria compressa.
   • Usa una pipetta pulita per riempire la cuvetta per 3/4 con la soluzione di β-carotene da 3,7 μM. Pulire i lati della cuvetta, inserirla nello spettrometro ed eseguire la scansione come un altro campione.
   • Quando la scansione finisce, annota l'assorbanza del picco a 450 nm. Ripetere l'operazione per le restanti soluzioni, lavorando dalla concentrazione più bassa a quella più alta. Salva i tuoi dati quando hai finito.
   • Infine, svuota la cuvetta nei rifiuti organici e puliscila con acetone.
3. RisultatiEspandi

   Per prima cosa, guarda gli spettri dei tre coloranti. La fluoresceina in acqua assorbe la luce blu e viola, con l'assorbanza massima a 490 nm. Non assorbe la luce rossa e assorbe solo un po' di luce gialla e verde. Coerentemente con ciò, la fluoresceina solida è rossa e le soluzioni di fluoresceina sono solitamente da gialle a verdi.

   β-carotene assorbe anche la luce blu e viola. L'assorbanza massima del β-carotene nell'esano è di 450 nm e vedrai un altro grande picco a 478 nm. Il forte assorbimento della luce viola è parte del motivo per cui il β-carotene appare arancione.

   L'indaco nel DMF assorbe la luce UV e la luce rossa, arancione e gialla, con un picco distinto a 611 nm. Pertanto, il colorante indaco riflette principalmente la luce blu e viola, conferendogli il suo colore caratteristico.

   • Ora, fai la curva di calibrazione per la concentrazione di β-carotene. Tracciare i valori di assorbanza del β-carotene a 450 nm dalla seconda metà del laboratorio rispetto alle concentrazioni delle soluzioni.
   • Allora, applica una linea di tendenza e trova l'equazione lineare che si adatta ai dati. Secondo la legge di Beer-Lambert, in questa equazione, y è l'assorbanza, x è la concentrazione e la pendenza è il prodotto del coefficiente di attenuazione molare pertinente e della lunghezza del percorso.
   • Controlla la tua equazione. Riorganizzarlo per risolvere la concentrazione e riempire l'assorbanza di β-carotene a 450 nm dalla prima parte del laboratorio. La concentrazione calcolata dovrebbe essere vicina a 3 μM/L.