7.8: Ricombinazione omologa

La reazione di base della ricombinazione omologa (HR) coinvolge due cromatidi che contengono sequenze di DNA che condividono un tratto significativo di identità. Una di queste sequenze utilizza un filamento di un altro come modello per sintetizzare il DNA in una reazione catalizzata da un enzima. Il prodotto finale è una nuova fusione dei due substrati. Per garantire un'accurata ricombinazione delle sequenze, l'HR è limitata alle fasi S e G2 del ciclo cellulare. In queste fasi, il DNA è già stato replicato e la probabilità di una sequenza di DNA identica o simile su un cromatide fratello è alta. Pertanto, i tempi di riparazione impediscono la ricombinazione tra sequenze non identiche. Questa è una caratteristica critica dell'HR, in particolare durante la ricombinazione delle sequenze di DNA parentale in una prole, dove l'HR difettoso può portare alla perdita dell'intero gene e della regione cromosomica circostante.

L’accurata riparazione garantita dall’HR è stata applicata nelle tecniche di editing genetico. L'HR è il primo metodo utilizzato per modificare i genomi nelle cellule viventi. Il sistema CRISPR-Cas9 viene utilizzato per creare rotture mirate del doppio filamento per correggere le mutazioni che causano malattie nel genoma. I frammenti isolati vengono assorbiti dalle cellule, dove possono ricombinarsi con il DNA cellulare e sostituire la regione bersaglio del genoma. I meccanismi HR governano la riparazione delle rotture e la loro accurata ricombinazione con il genoma cellulare. Per aiutare le proteine HR a localizzarsi precisamente in corrispondenza delle rotture del doppio filamento, le proteine Cas9 sono fuse con proteine effettrici HR che possono reclutare proteine di riparazione nei siti danneggiati. Gli studi hanno dimostrato che la fusione di Cas9 con proteine come CtIP, Rad52 e Mre11 può aumentare gli eventi HR nella cellula di due volte scoraggiando l'unione delle estremità non omologhe. Tali applicazioni delle risorse umane nell’editing del genoma possono rivoluzionare la terapia genica e fornire cure per malattie genetiche attualmente considerate incurabili.

Un requisito essenziale della replicazione del DNA è di mantenere l'integrità del materiale genetico. per questo motivo, le interruzioni a doppio filamento sono riparate preferenzialmente dalla ricombinazione omologa;ciò è tipicamente effettuato dopo la sintesi del DNA, quando le due molecole del DNA figlio sono in prossimità ed una può servire come stampo per la riparazione dell'altra. Negli eucarioti, un complesso proteico chiamato MRN, composto da nucleasi specializzate, degrada le estremità danneggiate del DNA mentre le estremità sono tra loro legate.

Il DNA viene lasciato con sporgenze a singolo filamento di tre a quattro nucleotidi con una fine OH a 3 primi. Questa sezione a singolo filamento è stabilizzata dalle proteine RPA 00:00:46.290 00:00:51.360 fino a RAD51, l'omologo della proteina procariotica RecA;sono attivate dall'ATP e si legano al DNA formando un filamento. Nel filamento, il DNA esiste come triplette di nucleotidi dove la struttura del DNA viene svolta tra le triplette adiacenti.

Questo filamento di proteina di DNA viene legato ad un DNA duplex da un cromatide fratello allungando il template intatto di DNA e destabilizzandolo, in modo che i due filamenti possano 00:01:17.130 00:01:20.040 essere facilmente messi da parte e che il filamento rotto possa tentare di legarsi al template in un processo conosciuto come invasione del filamento. Il filamento invadente cerca sequenze omologhe non danneggiate nel DNA genomico per poter formare le coppie di basi in un blocco di tre nucleotidi. Se le coppie di basi non corrispondono, il DNA invadente si dissocia e cerca altre regioni omologhe.

Se una tripletta del filamento invasore corrisponde al modello, allora i tre nucleotidi successivi vengono valutati. Se una sequenza corrisponde per un tratto di almeno cinque triplette, viene formata una struttura ad anello di spostamento con la DNA polimerasi usando il filamento invaso come modello. In seguito, un'elicasi, sposta il filamento invadente, ora esteso, che si accoppia con il filamento danneggiato non rivestito.

Successivamente, il secondo filamento danneggiato si ricongiunge al filamento complementare del DNA stampo, per un altro ciclo di sintesi del DNA. Infine, i filamenti fratelli si dissociano. e una DNA ligasi sigilla i nick, restaurando le eliche riparate e assicurando la riparazione accurata del cromosoma intatto.