11.11: CRISPR e crRNA

I batteri e gli archea sono suscettibili alle infezioni virali proprio come gli eucarioti; pertanto, hanno sviluppato un sistema immunitario adattivo unico per proteggersi. Brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate e proteine associate a CRISPR (CRISPR-Cas) sono presenti in più del 45% dei batteri conosciuti e nel 90% degli archaea conosciuti.

Il sistema CRISPR-Cas memorizza una copia del DNA estraneo nel genoma ospite e la utilizza per identificare il DNA estraneo dopo la reinfezione. CRISPR-Cas ha tre diverse fasi per attaccare un virus che si reinfetta. Nella fase di acquisizione, la regione protospacer del DNA virale viene tagliata dai sistemi CRISPR. La regione specifica del protospacer viene identificata per la scissione con l'aiuto di un motivo adiacente al protospacer (PAM) presente nel DNA virale bersaglio. La sequenza del protospacer scissa viene quindi incorporata nel locus batterico CRISPR. Nella fase di espressione, i geni CRISPR e CAS vengono trascritti per produrre l'RNA pre-CRISPR (crRNA) e l'mRNA Cas. Il pre-crRNA viene quindi elaborato per produrre crRNA maturo. Nella fase di interferenza, il crRNA e la proteina Cas tradotta formano un complesso ribonucleoproteico che prende di mira e scinde il DNA virale in modo sequenza-specifico.

I sistemi CRISPR-Cas possono essere suddivisi in tre tipi distinti caratterizzati dai loro tipi di proteina Cas. Nei sistemi di tipo I, Cas3 ha attività elicasi e nucleasi. Molteplici proteine Cas aggiuntive creano una rottura a doppio filamento nel DNA virale. Nei sistemi di tipo II, la nucleasi Cas9 agisce da sola per scindere il DNA. Oltre al crRNA, i sistemi di tipo II possiedono anche il CRISPR RNA transattivante (tracrRNA), necessario per la maturazione del crRNA. Nei sistemi di tipo III, Cas10 ha una funzione sconosciuta, ma come il sistema di tipo I, necessita di più proteine per la scissione del DNA. Il sistema di tipo III può anche prendere di mira l'RNA per la scissione. Il tipo I e il tipo III si trovano sia nei batteri che negli archaea, mentre fino ad oggi il tipo II è stato trovato solo nei batteri. Rispetto alle tecniche convenzionali di modifica del genoma come gli enzimi di restrizione, il sistema CRISPR-Cas è più semplice da usare e può colpire più geni nello stesso esperimento; pertanto, è emerso come un potente strumento di ingegneria genetica ed è ampiamente utilizzato per modificare il genoma degli organismi sia procariotici che eucariotici.

I batteri continuamente affrontano infezioni da parte di virus batteriofagi, virus che infettano i batteri. Per affrontare questa minaccia, i batteri hanno sviluppato un sofisticato sistema di immunità adattativa noto come il sistema CRISPR-Cas per distruggere il DNA batteriofago in caso di reinfezione. Il sistema prevede tre diversi processi:l'incorporazione del segmento del DNA batteriofago nel genoma batterico, la produzione del CRISPR RNA e la proteina Cas e la scissione mediata da CRISPR RNA-CAS del DNA batteriofago.

Quando un batteriofago é in azione, esso si attacca alla superficie della cellula batterica e inserisce il suo DNA nei batteri che vengono poi scissi dal sistema batterico. Un breve segmento del DNA del batteriofago viene quindi aggiunto in regioni specifiche del genoma batterico chiamate CRISPR-o ripetizioni palindromiche brevi e interspaziate regolarmente in cluster. Queste sono regioni genomiche in cui le ripetizioni di sequenza batterica sono intervallate dalle brevi sequenze spaziatrici variabili da diversi batteriofagi.

Queste sequenze spaziatrici servono come memoria per i batteri di tutti i batteriofagi che hanno precedentemente attaccato. I batteri usano sequenze spaziatrici per identificare e distruggere rapidamente il DNA da un particolare tipo di batteriofago se li attacca di nuovo. Le trascrizioni della regione CRISPR vengono processate per produrre molecole di RNA CRISPR intorno a 30 nucleotidi lunghi che contengono lo spaziatore e la sequenza di ripetizione batterica vicina.

Il CRISPR associato, o sistemi Cas, codificano la proteina Cas. Questa proteina Cas poi si associa con la molecola CRISPR RNA per formare un complesso ribonucleoproteico. Quandolo stesso tipo di batteriofago attacca di nuovo, il suo DNA è riconosciuto dalla sua specifica sequenza spaziatrice presente nell'RNA CRISPR.

La proteina CAS associata allora, o da sola o con l'aiuto di proteine multiple, taglia entrambi i filamenti del DNA del batteriofago. I principi del sistema Cas CRISPR e dei suoi componenti possono essere utilizzati per abbattere o modificare qualsiasi gene in un organismo che utilizza il suo RNA guida complementare. Diversi tipi di sistema Cas CRISPR sono presenti in batteri e arcaea.

Tra questi, il sistema CRISPR Cas9 è uno dei più studiati e ampiamente utilizzato per diverse applicazioni pratiche in quanto può essere facilmente ed efficacemente riprogrammato per avere diversi geni come target.