15.2: Isolamento del DNA

I protocolli di isolamento del DNA possono essere rapidi e diretti o complessi e richiedere molto tempo a seconda del tipo e della qualità del DNA richiesto per l'ulteriore elaborazione. Ad esempio, l'estrazione del DNA plasmidico è un po' più complicata dell'estrazione del DNA genomico a causa della necessità di un metodo di lisi appropriato per separare il DNA plasmidico dal gDNA durante l'isolamento. Tuttavia, per applicazioni specifiche, come il sequenziamento del DNA a lungo raggio che richiede una buona resa di campioni di DNA di alta qualità, dobbiamo seguire protocolli specifici anche per l’estrazione del DNA genomico.

Tipi di metodi di estrazione del DNA genomico

Lo scopo principale dei metodi di estrazione del DNA genomico è separare il gDNA dalle proteine, dall'RNA e da altro contenuto cellulare. Comprende quattro passaggi fondamentali: 1. Distruzione della struttura cellulare meccanicamente o utilizzando sostanze chimiche per ottenere il lisato cellulare 2. Protezione del DNA dalla degradazione durante la lavorazione 3. Separazione del DNA solubile dai detriti cellulari 4. Eluizione del DNA purificato.

La maggior parte dei protocolli di isolamento del DNA genomico sono metodi di estrazione in soluzione o in fase solida. I metodi basati su soluzioni si basano su fasi di precipitazione e centrifugazione per separare il DNA da altro materiale cellulare, seguite dall'estrazione organica o "salatura" per separare il DNA solubile dalle proteine cellulari. La precipitazione finale del DNA viene effettuata utilizzando etanolo. Al contrario, i metodi di estrazione in fase solida utilizzano un supporto solido, come matrici di silice o cellulosa, per legare il DNA, seguito dal lavaggio e dall'eluizione del DNA dal supporto solido. Implica la centrifugazione, il vuoto o metodi magnetici per separare il DNA legato da altri componenti cellulari.

La scelta del metodo di estrazione del gDNA dipende dal tipo di campione, dal numero di campioni da elaborare contemporaneamente e dall'applicazione a valle del DNA.

Il DNA deve essere isolato dalle cellule e tagliato in posizioni precise per molte applicazioni, come la tecnologia del DNA ricombinante.

Sebbene vengano utilizzati diversi tipi di metodi di estrazione del DNA per diversi tipi di cellule, ci sono tre fasi standard: lisi cellulare, rimozione delle proteine e recupero del DNA.

All'interno delle cellule eucariotiche, il DNA è impacchettato all'interno del nucleo. Pertanto, sia la membrana cellulare che la membrana nucleare devono essere rotte per isolare il DNA.

Questo passaggio può essere eseguito meccanicamente scomponendo le cellule attraverso la macinazione o la sonicazione, o chimicamente utilizzando detergenti ed enzimi per dissolvere parti della membrana cellulare.

Una volta che il contenuto delle cellule viene rilasciato, i detriti vengono separati dai componenti solubili mediante centrifugazione. Il surnatante recuperato contiene acidi nucleici e proteine idrosolubili.

Per rimuovere le proteine, gli enzimi, come la proteinasi K, la peptidasi o il lisozima, vengono aggiunti al surnatante per rompere i legami peptidici.

Il DNA viene recuperato dal surnatante attraverso la precipitazione aggiungendo alcol e un sale, come l'acetato di sodio.

Il precipitato isolato viene disciolto in acqua o in un tampone.