Southern Blot

Il Southern blotting è una tecnica in cui una sonda di DNA marcata si ibrida con un DNA bersaglio per rilevare una particolare sequenza all'interno di un genoma.

La tecnica prende il nome da Edwin Southern, il biologo britannico che per primo l'ha sviluppata.

La procedura segue cinque fasi principali: elettroforesi, denaturazione, trasferimento della membrana, ibridazione e visualizzazione.

In primo luogo, il DNA genomico viene digerito dagli enzimi di restrizione e i frammenti di DNA risultanti vengono caricati su un gel di agarosio e separati mediante elettroforesi su gel.

Per la denaturazione o la separazione del DNA a doppio filamento in due DNA a filamento singolo, o ssDNA, il gel viene immerso in una soluzione di idrossido di sodio.

Il gel viene quindi posto su una spugna in una soluzione neutralizzante del DNA contenente cloruro di sodio e tampone tris, per ripristinarne il pH a 7,0.

Successivamente, una membrana di nylon viene posizionata sopra il gel e appesantita con una pila di tovaglioli di carta. L'ssDNA si trasferisce sulla membrana attraverso l'azione capillare, mentre l'alta concentrazione di sale nella soluzione neutralizzante aiuta il DNA a legarsi.

Quando viene irradiato con raggi UV, il DNA diventa reticolato covalentemente alla membrana. Questo impedisce la diffusione e immobilizza le bande di DNA.

La membrana viene quindi immersa in una soluzione di DNA spermatico di salmone denaturato. La soluzione riveste la membrana e impedisce qualsiasi legame non specifico con il DNA della sonda.

Le sonde sono DNA corto a filamento singolo che hanno una sequenza complementare ai frammenti di DNA bersaglio. Per la visualizzazione, le sonde sono marcate con un fosforo radioattivo, P-32, o con un enzima che genera un prodotto facilmente rilevabile.

Quando la membrana viene immersa in una soluzione tampone contenente le sonde e riscaldata a 42 °C, l'ssDNA bersaglio si accoppia con il DNA della sonda complementare per formare un DNA a doppio filamento ibrido marcato.

Dopo l'ibridazione notturna, la membrana viene lavata per rimuovere le sonde non legate.

Per il DNA marcato radioattivamente, la membrana viene esposta a una pellicola a raggi X per il rilevamento.

Le sonde marcate con enzimi possono essere rilevate aggiungendo un substrato appropriato e visualizzando le bande man mano che il colore o la luminescenza si sviluppano. Poiché le sonde marcate si legheranno solo alla sequenza di DNA di interesse, qualsiasi banda visibile indica la presenza del DNA bersaglio.