FISH - Ibridazione fluorescente in situ

L'ibridazione in situ a fluorescenza o FISH è una tecnica utilizzata per rilevare la posizione di geni specifici o parti di geni sui cromosomi all'interno di cellule fisse.

In questa tecnica, un DNA a singolo filamento marcato in fluorescenza viene utilizzato come sonda per legare parti di cromosomi che contengono una sequenza di DNA complementare, indicata come bersaglio.

In primo luogo, le cellule vengono arrestate in interfase o metafase. Le cellule arrestate vengono sospese in soluzione tampone e distribuite su un vetrino pulito.

Successivamente, il DNA bersaglio e le sonde marcate vengono denaturate con calore o sostanze chimiche. Questo passaggio separa il DNA a doppio filamento, lasciando sia la sonda che il DNA bersaglio come sequenze a singolo filamento in grado di appaiare le basi.

Quindi, la sonda e il DNA bersaglio vengono mescolati insieme e incubati durante la notte. Ciò consente alla sonda di ibridarsi nella sua sequenza complementare sui cromosomi.

Una volta completata l'ibridazione, la sonda in eccesso viene lavata via.

Se la sonda è stata marcata con un fluoroforo, le posizioni del DNA ibridato possono essere visualizzate direttamente con un microscopio a fluorescenza.

In caso contrario, il DNA ibridato deve essere marcato in fluorescenza prima della visualizzazione. Per fare ciò, la sequenza della sonda deve contenere un nucleotide modificato legato a un aptene, una piccola molecola a cui il fluoroforo, come un anticorpo fluorescente, può legarsi.

Tale visualizzazione diretta dei geni è molto utile per i saggi diagnostici basati sulle cellule, in cui le anomalie genetiche possono essere rilevate da qualsiasi perdita, guadagno... o riarrangiamento dei cromosomi durante la divisione cellulare.