Question 1

Perché il RACE viene utilizzato per ottenere sequenze di cDNA a lunghezza intera?

Accepted Answer

RACE viene utilizzato perché i nuovi trascrizioni di mRNA spesso producono cDNA parziali con sequenze sconosciute agli estremi 5' o 3'. Questa tecnica estende le sequenze di cDNA parziali da un sito interno noto agli estremi sconosciuti utilizzando la PCR ancorata, consentendo ai ricercatori di ottenere il cDNA completo per il trascritto.

Question 2

Come funziona il primer ibrido nella 3' RACE?

Accepted Answer

Il primer ibrido consiste in una sequenza oligo-dT collegata a una sequenza di ancoraggio unica. L'oligo-dT lega la coda poli-A all'estremità 3' degli mRNA maturi, mentre l'ancora aggiunge nucleotidi unici a monte della sequenza poli-T nel primo filamento di cDNA appena sintetizzato.

Question 3

Qual è il ruolo dei primer annidati nell'amplificazione RACE?

Accepted Answer

I primer annidati si legano a valle dei primer del primo ciclo PCR, aumentando la specificità e la resa dei cDNA a lunghezza intera. Poiché i primer adattatori possono amplificare sequenze off-target, un secondo ciclo di amplificazione con primer annidati riduce i prodotti non specifici e migliora il recupero del cDNA desiderato.

Question 4

In che modo la 5' RACE differisce dalla 3' RACE nell'ottenere sequenze sconosciute?

Accepted Answer

In 5' RACE, un primer specifico del gene si lega all'estremità 3' dell'mRNA durante la trascrizione inversa, poi la terminale desossinucleotidil transferasi aggiunge una coda poli-A all'estremità 3' del cDNA. Un primer adattatore con oligo-dT e sequenze di ancoraggio sintetizza poi il filamento complementare per amplificare la sequenza 5' mancante.

Question 5

Cosa sono i primer degenerati e perché possono causare problemi nel RACE?

Accepted Answer

I primer degenerati sono progettati come possibili sequenze terminali di cDNA previste dalle sequenze di aminoacidi delle proteine codificate. Poiché gli aminoacidi sono codificati da molteplici codoni di mRNA, prevedere sequenze nucleotidiche dalle sequenze proteiche è impreciso, portando i primer degenerati a produrre prodotti PCR indesiderati.

Question 6

Come i primers GI tail migliorano la specificità RACE rispetto ai primers ricchi di G?

Accepted Answer

I primers con coda GI contengono una miscela di guanine e inosine, aumentando la specificità della PCR e riducendo l'amplificazione fuori bersaglio. A differenza dei primer ricchi di G che richiedono temperature di annealing sostanzialmente più elevate, i primers con coda GI si annessano a temperature PCR standard, rendendoli più pratici per le applicazioni RACE di routine.

Question 7

Quali modifiche migliorano le prestazioni della tecnica RACE per ottenere il cDNA completo?

Accepted Answer

Le modifiche RACE includono l'ottimizzazione delle sequenze di ancoraggio, l'adattamento delle sequenze dei primer a specifici cDNA, l'uso di primer degenerati, il controllo della composizione GC, l'adeguamento della lunghezza dell'estremità del cDNA e l'impiego di code poli(C) con primer ibridi a coda GI. Questi miglioramenti aumentano la specificità e la resa delle sequenze di cDNA a lunghezza intera attraverso approcci sequenziamento di prossima generazione terminatore reversibile.

RACE - Amplificazione rapida delle estremità del cDNA

Browse More Videos