Sequenziamento di Sanger

Per alcuni esperimenti o diagnosi, potrebbe essere necessario ottenere la sequenza nucleotidica dell'intero genoma di un organismo per ottenere una comprensione più profonda dei geni o degli alleli presenti, della loro funzione e delle malattie associate. Ciò può essere ottenuto utilizzando il sequenziamento del DNA.

Due note tecniche tradizionali di sequenziamento del DNA sono il metodo di sequenziamento Sanger e il metodo Maxam-Gilbert.

Nel sequenziamento Sanger - noto anche come sequenziamento della terminazione della catena o sequenziamento dideossinucleotidico - il DNA stampo puro da sequenziare viene amplificato con PCR in presenza di opportuni primer, dNTP e basi modificate, chiamati dideossinucleotidi o ddNTP.

I dideossinucleotidi mancano del gruppo ossidrilico dei deossinucleotidi, il che limita la loro capacità di formare legami fosfodiestere con nucleotidi adiacenti.

Ogni dideossinucleotide è inoltre etichettato con un'etichetta fluorescente diversa per facilitarne il rilevamento.

Il primo passo è quello di denaturare il DNA stampo in un DNA a filamento singolo.

Quindi, quando i primer si legano alla regione di interesse, la DNA polimerasi inizia ad aggiungere nuovi nucleotidi al filamento di DNA e occasionalmente incorpora un dideossinucleotide invece di un deossinucleotide, che termina l'amplificazione del DNA.

Il risultato sono frammenti di DNA di varie lunghezze, ciascuno terminante con un dideossinucleotide marcato.

Questi frammenti di DNA vengono quindi fatti scorrere su un gel capillare per separarli in base alle dimensioni, e gli spettri di emissione di ciascuno di questi frammenti vengono analizzati attraverso un software automatizzato per decifrare la sequenza genetica del DNA desiderato.