Annotazione e assemblaggio del genoma

L'intero genoma di un organismo non può essere sequenziato in sequenze continue: anche l'ultima generazione di tecnologie di sequenziamento produce dati frammentati da migliaia di brevi frammenti di DNA di lunghezza compresa tra 50 e 1000 bp.

Queste brevi sequenze di DNA - chiamate reads - devono essere assemblate per ricostruire la sequenza completa di un genoma in un processo chiamato assemblaggio del genoma.

Ci sono quattro fasi principali in qualsiasi assemblaggio del genoma di nuova generazione: analisi dei dati grezzi, assemblaggio contig, scaffolding e, infine, chiusura delle lacune.

Il primo passo consiste nell'analizzare i dati grezzi acquisiti per verificarne la qualità e quindi eliminare qualsiasi contaminazione, dati distorti o letture di scarsa qualità con un gran numero di nucleotidi sconosciuti.

Successivamente, le letture pulite vengono tagliate per rimuovere le sequenze dell'adattatore dalle loro estremità. Vengono tagliate anche tutte le basi alle estremità del frammento che non superano la soglia di qualità.

Quindi, viene utilizzato uno strumento di assemblaggio adatto per assemblare le letture in sequenze contigue - chiamate contigs - basate sui segmenti di DNA sovrapposti.

L'assemblaggio comparativo del genoma può essere utilizzato quando è disponibile un genoma di riferimento di un organismo strettamente correlato per dirigere la ricostruzione del nuovo genoma. Qui, le letture sono allineate al genoma di riferimento e questo fornisce un layout per ulteriori passaggi nell'assemblaggio del genoma.

In alternativa, l'assemblaggio del genoma de novo deve essere eseguito in assenza di un genoma di riferimento. In questo caso, le letture sovrapposte vengono utilizzate per orientare le sequenze in contigs più lunghi.

Nella fase successiva, le letture brevi accoppiate - che sono letture sporgenti alla fine dei contig - vengono utilizzate per lo scaffolding del genoma.

Gli spazi tra i contig adiacenti sono riempiti con N in caso di sequenze sconosciute. Tuttavia, se si utilizzano letture lunghe di lunghezza superiore a 1 kb per unire i conti, gli spazi vuoti possono essere riempiti con sequenze effettive.

Il risultato è un genoma assemblato che deve poi essere annotato con l'aiuto di strumenti automatizzati, un processo chiamato annotazione del genoma.

I due obiettivi principali dell'annotazione del genoma sono la struttura genica e la previsione della funzione genica, comunemente note rispettivamente come annotazione strutturale e annotazione funzionale.

Mentre l'annotazione strutturale porta all'identificazione degli elementi genomici come le regioni codificanti, i motivi regolatori, ecc., l'annotazione funzionale aiuta a identificare correttamente la funzione biologica di questi elementi strutturali, in particolare i geni codificanti proteine.

Gli strumenti di annotazione del genoma utilizzano i dati disponibili, tra cui trascritti noti, sequenze proteiche o segnale, geni previsti da altri genomi sequenziati o firme di domini conservati, come riferimenti per qualsiasi nuova annotazione.

Una volta che il software allinea questi dati disponibili al genoma in bozza, deve essere filtrato e lucidato manualmente o utilizzando strumenti di annotazione per ottenere un set finale di annotazioni genetiche.