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Ibridazione in situ
L'ibridazione in situ (ISH) è una tecnica utilizzata per rilevare e localizzare specifiche molecole di DNA o RNA in cellule, tessuti o sezioni di tess…
L'ibridazione in situ è una tecnica utilizzata per localizzare il DNA o l'RNA in cellule in coltura o in sezioni di tessuto conservate chimicamente.
L'ibridazione in situ dell'RNA viene utilizzata per monitorare dove viene espresso un gene rilevando e quantificando i trascritti specifici dell'mRNA.
Gli mRNA bersaglio vengono rilevati da sonde di RNA complementari a singolo filamento create mediante trascrizione in vitro di un modello di DNA o sintetizzate mediante una reazione chimica.
Le sonde sono marcate con isotopi radioattivi, fluorofori o altre molecole reporter, come la biotina o la digossigenina, che possono essere legate e rilevate da un anticorpo marcato.
L'ibridazione in situ dell'RNA ha quattro fasi principali: fissazione tissutale, permeabilizzazione, ibridazione e rilevamento.
Per iniziare, il tessuto fresco viene raccolto e trattato chimicamente per fermare qualsiasi reazione biochimica all'interno del tessuto e preservarne l'integrità strutturale. Questa tecnica di conservazione è chiamata fissazione tissutale.
Successivamente, le proteine e i lipidi nel tessuto devono essere rimossi affinché la sonda possa accedere e legare l'RNA bersaglio.
Per degradare le proteine e permeabilizzare la membrana cellulare, il campione viene trattato con acido cloridrico 0,2 molare ed enzimi come le proteinasi, mentre vengono utilizzati detergenti per scomporre i lipidi.
L'RNA bersaglio viene quindi ibridato con le sonde a una temperatura appena inferiore al punto di fusione dell'ibrido RNA-sonda. Questo aiuta le sonde a ricuocere con gli mRNA complementari. Le sonde non legate e allentate vengono rimosse eseguendo diversi lavaggi.
Il metodo per rilevare le sonde ibridate dipende dal tipo di etichetta. Le sonde radioattive sono esposte a pellicole fotografiche, mentre le sonde fluorescenti sono visibili al microscopio a fluorescenza.
Per altre marcature, gli anticorpi contro la molecola reporter sono marcati con un colorante fluorescente o colorimetrico.
Il rilevamento di sonde ibridate rivela la distribuzione di mRNA specifici indicando dove sono espressi i geni di interesse.
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Q1: What is in situ hybridization used for in molecular biology?
In situ hybridization is a technique that detects and localizes specific DNA or RNA molecules in cultured cells or preserved tissue sections. RNA in situ hybridization specifically monitors where genes are expressed by detecting and quantifying mRNA transcripts using complementary RNA probes labeled with radioactive isotopes, fluorophores, biotin, or digoxigenin for visualization.
Q2: What are the four main steps of RNA in situ hybridization?
The four main steps are tissue fixation, permeabilization, hybridization, and detection. Tissue fixation chemically preserves structural integrity. Permeabilization removes proteins and lipids using hydrochloric acid, proteinases, and detergents to allow probe access. Hybridization anneals probes to complementary mRNAs at controlled temperatures. Detection reveals mRNA distribution using methods suited to the probe label type.
Q3: How do different probe labels affect detection in in situ hybridization?
Detection methods depend on the probe label type. Radioactive probes are exposed to photographic films via autoradiography. Fluorescent probes are visualized under fluorescent microscopes. For other labels like biotin or digoxigenin, antibodies tagged with fluorescent or colorimetric dyes bind the reporter molecule for visualization, enabling flexible detection strategies.
Q4: What types of probes are used in in situ hybridization?
Multiple probe types are employed, including single-stranded DNA probes, double-stranded DNA probes, antisense RNA probes (riboprobes), and synthetic oligodeoxynucleotide probes. Probe selection depends on sensitivity, specificity, stability, and tissue penetration ability. These probes are complementary strands that bind to corresponding nucleotide sequences in cells or tissue samples.
Q5: Why is tissue permeabilization necessary in in situ hybridization?
Tissue permeabilization removes proteins and lipids that block probe access to target RNA. The sample is treated with hydrochloric acid and proteinases to degrade proteins and permeabilize cell membranes, while detergents break down lipids. This step ensures probes can penetrate tissue and successfully anneal with complementary mRNA sequences.
Q6: What are the advantages of in situ hybridization for gene expression analysis?
In situ hybridization can be applied to frozen tissues, maximizing use of difficult-to-obtain samples. It can be combined with other techniques like immunohistochemistry to detect both protein and active mRNA simultaneously. However, samples with low DNA and RNA copy numbers may present challenges for target identification.
Q7: How are probes labeled and detected in in situ hybridization?
Probes are labeled using radioisotopes (3H, 35S, 32P), non-radioactive labels (biotin, digoxigenin, fluorescein), or fluorescent dyes attached via end-labeling, nick-translation, or random primer synthesis. These labeled probes enable detection through reporter genes or antibodies tagged with fluorescent or colorimetric dyes, allowing visualization of hybridized target sequences.