5.15
Profilatura ribosomiale
La profilazione ribosomiale o ribosequenziamento è una tecnica di sequenziamento profondo che produce un'istantanea della traduzione attiva in una cel…
Identificare le regioni di un genoma che vengono trascritte e tradotte in proteine è un passo fondamentale per comprendere un genoma e la sua espressione.
Ciò si ottiene con una tecnica chiamata profilazione dei ribosomi, nota anche come ribo-seq. Mappa le posizioni dei ribosomi sull'mRNA e identifica gli mRNA che vengono attivamente tradotti in proteine.
Per isolare l'RNA, le cellule devono prima essere lisate per accedere alle molecole al loro interno. Il lisato viene quindi trattato con RNasi. Questi enzimi scindono gli mRNA che non sono ricoperti di ribosomi, lasciando solo i frammenti di mRNA protetti.
I frammenti protetti dal ribosoma vengono quindi separati dai frammenti non protetti e tagliati utilizzando un gradiente di saccarosio.
I ribosomi vengono quindi rimossi dai frammenti di mRNA e l'RNA viene convertito in DNA mediante RT-PCR, utilizzando l'enzima trascrittasi inversa.
Successivamente, il DNA viene sequenziato e mappato sul genoma di riferimento. Questo determina l'esatta posizione del ribosoma lungo ciascun mRNA.
La profilazione dei ribosomi può anche aiutare a identificare frame di lettura aperti o ORF non riconosciuti. Un ORF è una regione del DNA tra un codone di inizio e un codone di arresto che può essere tradotta in proteina. Trovare ORF può essere utile nell'identificazione di nuovi geni.
Si consideri lo studio dei modelli di espressione genica in una linea cellulare di mammifero. La procedura sperimentale prevede l'esposizione delle cellule a stimoli che possono attivare l'espressione genica e avviare la sintesi dell'mRNA.
Gli mRNA che vengono tradotti attivamente vengono identificati utilizzando la profilazione dei ribosomi.
Questo esperimento rivela che il gene B viene tradotto mentre i geni A e C no.
Mostra anche che un'ulteriore piccola regione del genoma, lunga circa un centinaio di nucleotidi, viene tradotta attivamente.
Questa regione non riconosciuta è un frame di lettura aperto che può codificare per una nuova proteina che è sovraregolata dagli stimoli sperimentali.
View the full transcript and gain access to JoVE Core videos
Q1: What is ribosome profiling and what does it measure?
Ribosome profiling, also called ribo-seq, is a deep sequencing technique that maps ribosome positions on mRNA to identify actively translated genes. It produces a snapshot of the translation landscape in a cell at any given moment by selectively sequencing mRNAs protected by ribosomes, revealing which genes are being translated into proteins.
Q2: How does ribosome profiling isolate and protect mRNA fragments?
Cells are lysed to access internal molecules, then the lysate is treated with RNases that cleave unprotected mRNAs. Ribosomes shield their bound mRNA from cleavage, leaving only ribosome-protected fragments. These protected fragments are then separated from cleaved fragments using a sucrose gradient for further analysis.
Q3: What role do open reading frames play in ribosome profiling analysis?
Ribosome profiling identifies open reading frames (ORFs), which are DNA regions between start and stop codons that can be translated into proteins. Discovering unrecognized ORFs helps identify new genes and novel proteins. In experimental studies, ribosome profiling can reveal previously unknown translated regions upregulated by specific cellular stimuli.
Q4: How is ribosomal RNA contamination addressed in ribosome profiling?
Ribosomal RNA (rRNA) that binds to mRNA is typically removed during ribosome profiling. However, rRNA contaminants sometimes persist. Researchers use the duplex-specific nuclease (DSN) enzyme, isolated from the Kamchatka crab hepatopancreas, which cleaves dsDNA and DNA-RNA hybrids to reduce rRNA contamination in samples.
Q5: What technical challenges does ribosome profiling face?
Ribosome profiling requires large sample amounts, timely translation inhibition, and managing RNA contamination. Flash-freezing efficiently captures ribosome distribution compared to elongation inhibitors like cycloheximide. Data analysis also demands bioinformatics expertise; the riboSeqR R package helps overcome this limitation by providing methods for resolving profiling data across multiple samples.
Q6: How does ribosome profiling convert mRNA to DNA for sequencing?
After ribosomes are removed from protected mRNA fragments, the RNA is converted into DNA using reverse transcriptase through RT-PCR. The resulting DNA is then sequenced and mapped onto a reference genome to determine the exact ribosome location along each mRNA molecule.
Q7: What applications does ribosome profiling have in studying gene expression?
Ribosome profiling enables in vivo monitoring of translation in specific organs or tissues and quantifies new protein synthesis levels. It discovers translated products including short peptides and protein isoforms with unknown functions. The technique also identifies mRNAs that remain untranslated until receiving external signals, revealing dynamic translation regulation.