Articolo metodologico

Channelrhodopsin2 stimolazione mediata dei potenziali Synaptic a Drosophila Giunzioni neuromuscolari

DOI:

10.3791/1133

⸱

16 marzo 2009

 ,  , 
1Department of Biology, Brandeis

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa procedura utilizza una luce blu-attivati ​​canali delle cellule algali e strumenti specifici per l'espressione genetica di evocare i potenziali sinaptici con impulsi di luce a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) in Drosophila Larve. Questa tecnica è un poco costoso e facile da usare alternativa alla stimolazione dell'elettrodo di aspirazione per gli studi di fisiologia sinaptica nella ricerca e laboratori didattici.

Protocollo

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Parte 1: la cura degli animali e croci genetica

  1. Mantenere UAS-ChR2 e OK371-GAL4 linee di volare in bottiglie separate contenenti supporti standard 8 volare.
  2. Raccogliere vergini di OK371-GAL4 linee volo ed i maschi di UAS-ChR2 linee.
  3. Mettere maschi e femmine in una fiala contenente dei media volare miscela standard con 1 mM tutto-trans retinico (ATR). ATR cibo dovrebbe essere presa da primo media volare fusione regolare in un forno a microonde per circa 1 minuto. Una volta sciolto, lasciare raffreddare per circa 30 secondi a un minuto e poi aggiungere 100 ml di 100 mM ATR in 100 ETOH% per ogni 10 ml di media volare. Fiale luogo il ghiaccio, quindi memorizzare in una zona al buio a 4 ° C.
  4. Lascia compagno di mosche e depongono le uova in una zona al buio a 22-25 ° C.
  5. Attendere 3-4 giorni fino al 3 larve instar sono visibili, a quel punto, disporre di mosche adulte.

Parte 2: configurazione Rig

  1. Allegare eventuali 10x dissezione oculare portata (nel nostro caso, da Carl Zeiss Inc., www.zeiss.com, Thornwood, NY), al blu sorgente luminosa a LED con dissipatore di calore (laboratori di Thor, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Fissare a base magnetica con post e morsetto. Coprire dissipatore con uno schermo a massa per ridurre il rumore elettrico generato dalla sorgente luminosa.
  2. Luogo base magnetica con sorgente di luce sul tavolo aria di elettrofisiologia rig.
  3. Collegare la fonte di luce per il controllo del circuito e collegare al circuito di controllo di tensione esterna (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).
  4. Dare impulsi di 1-5 V per circuito di controllo per attivare la luce blu.
  5. Regola base magnetica e la fonte di luce fino a fascio di luce blu è focalizzata sulla zona da occupata da dissezione larvale.

Parte 3: Dissection

  1. Luogo sei pin 0,1 millimetri di insetti sul pavimento di una sylgard alberato piatto.
  2. Rimuovere un 3 ° larve instar dai media cibo e il luogo in qualsiasi plastica Petri-piatto.
  3. Sciacquare larve con soluzione salina per rimuovere gli alimenti.
  4. Larve posto nella dissezione piatto vicino al pin tirato e aggiungere saline al livello ½.
  5. Orientare le larve in modo che potete vedere due tubi argentati (trachea) che corre lungo la superficie dorsale dell'animale.
  6. Inserire un perno di grandi dimensioni direttamente in coda tra i tubi tracheali. Tenere le larve verso il basso e inserire un secondo perno di grandi dimensioni in testa, avendo cura di allungare il corpo in senso longitudinale.
  7. Fai una piccola incisione vicino alla coda, e continuate in su la lunghezza del corpo. Assicurarsi che le punte delle forbici sono allevati in modo da non tagliare accidentalmente nervi ventrale e / o dei muscoli della parete del corpo.
  8. Posto quattro perni sui quattro angoli del tronco dell'animale ormai aperto. Metterli nel piatto dissezione in modo da raccordare l'animale. Preparazione pin out insegnato.
  9. Con pinze e forbici, togliere viscere dell'animale, trachea e corpi grassi.
  10. Sciacquare la preparazione con soluzione salina.
  11. Individuare i lobi frontali (come si vede in Fig. A) e ganglio ventrale della preparazione.
  12. Utilizzando micro-forbici, tagliare con attenzione attraverso il ganglio ventrale appena dietro i lobi frontali.

Parte 4: la registrazione e la stimolazione muscolare azzurro

  1. Tirare un 10-20 elettrodo μω utilizzando un elettrodo estrattore elettronico (Sutter Instruments).
  2. Riempire l'elettrodo tirato con 3 M KCl.
  3. Luogo pieno di elettrodi nel porta elettrodo e elettrodo punta manovra con un micromanipolatore vicino preparazione larvale sotto microscopio da dissezione elettrofisiologia su rig.
  4. Identificare muscolare 6 (M6) in ogni segmento di parete del corpo (Fig. A).
  5. Inserire con cautela elettrodo nella M6 e guardare per iperpolarizzazione rapida. Potenziali di membrana muscolare a riposo dovrebbe essere ovunque da -30 mV a -70 mV.
  6. Regolare la luce blu in modo che la preparazione è centrata sezionato in fascio di luce.
  7. Dare impulsi di tensione 20-100 ms per il controllo del circuito. Aumentare in misura apprezzabile tensione fornita al circuito di controllo. Guarda per i potenziali di giunzione eccitatori nella cellula muscolare (Figura 1B).

Rappresentante dei risultati:

La figura 1A mostra uno schema del sistema di registrazione e la preparazione in filetti. Figura 1B mostra EJP tipici evocato da brevi impulsi di luce. Ampiezza EJP mostrata è riassunta ampiezza da due neuroni motori conosciuta da entrambe le innervare M6. Intensità di luce inferiore solo attivato una unità di motore (dati non riportati).

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Figura 1: A) Schema generale di un impianto di registrazione intracellulare e con LED blu. Cervello (Br) viene rimosso per inibire l'attività ritmica nel ganglio ventrale (VG). ChR2 è espresso in neuroni motori utilizzando il GAL4-UAS sistema. B) la registrazione intracellulare da un muscolo M6. 40 ms impulsi di luce blu (a 127 μW / mm 2) affidabile evocano grandi potenzialità sinaptiche (asterischi) in M6.

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Discussione

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Passaggi critici coinvolgono sia la dissezione iniziale e l'ingresso delle cellule muscolari. Se i nervi vengono tagliati o muscolo viene danneggiato durante la dissezione iniziale è difficile continuare il resto della sperimentazione. Durante la dissezione, bisogna stare molto attenti a sezionare le forbici angolo verso l'alto il più possibile durante l'incisione dorsale. Durante il secondo passo fondamentale, entrando in una cellula muscolare, si deve guardare per un passato iperpolarizzazione ~ 30 mV. I v...

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Dichiarazioni

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Noi non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of concede Salute RO1GM-33205 e MH-067284-LC Griffith e da una borsa di studio estiva Brandeis di ricerca dell'Università di laurea a New Jersey Hornstein. Esperimenti preliminari per questa tecnica sono stati eseguiti presso il Marine Biological Laboratory come parte del 2008 e l'estate dei sistemi neurali corso Behavior (NIMH sovvenzione: R25 MH059472) in Woods Hole, Massachusetts.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
SylgardEllsworth Adhesives4019862www.ellsworth.com
Minutens PinsFine Science Tools26002-10www.finescience.com
Piatto di dissezioneFisher Scientificwww.fishersci.com
Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head StageA-M Systems680100www.a-msystems.com
Sistema di acquisizione dati Powerlab 4/30figure-materials-1 ADInstrumentswww.adinstruments.com
Stimolatore per erbaGrass Technologies www.grasstechnologies.com
Computer desktopDellwww.dell.com
Cannocchiale di dissezioneLeica Microsystemswww.leica-microsystems.com
Sorgente luminosaDolan-Jenner Industries41446-062www.dolan-jenner.com
Fly Media
All-Trans-RetinalSigma-Aldrich116-31-4<a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com
OK-371 Gal4 VolaBloomington Stock center
UAS-ChR2 MoscheFiala lab, Griffith lab
LED controller circuitCostruito in Griffith labhttp://www.ledsupply.com
http:// www.futureelectronics.com
Composto da:
1. 200 mA Buck Puck
2. LED blu
3. Filo isolato
4. Circuito breadboard
LED Dissipatore di caloreThorlabs Inc.http://www.thorlabs.com/
Air TableTMChttp://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html
Gabbia di Faradaycostruita nel laboratorio
Leica Leitz M Micro-ManipolatoreLeica MicrosystemsACS01www.leica-microsystems.com
PortaelettrodoAxon Instrumentswww.axon.com
Vetro borosilicatoFHC, Inc.www.fh-co.com/p14-15.pdf
Estrattore di elettrodiSutter Instrument Co.www.sutter.com
HL 3.1 Soluzione salina con 0.8mM Ca2+Contenuto (mM):
NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8
MgCl2:4Saccarosio:115
NaHCO3: 10 Trealosio: 5
strumenti di micro-dissezionela scienza finewww.finescience.com
Griffith HEPES Strumenti per

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).
  2. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).
  3. Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).
  4. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).
  5. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).
  6. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).
  7. Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707(1995).
  8. Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).

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Channelrhodopsin2Drosophila Neuromuscular JunctionSynaptic PotentialsGAL4 UAS SystemBlue Light StimulationElectrophysiology RigMuscle RecordingLarval DissectionExcitatory Junctional PotentialAll Trans Retinol

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