Questa procedura utilizza una luce blu-attivati canali delle cellule algali e strumenti specifici per l'espressione genetica di evocare i potenziali sinaptici con impulsi di luce a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) in Drosophila Larve. Questa tecnica è un poco costoso e facile da usare alternativa alla stimolazione dell'elettrodo di aspirazione per gli studi di fisiologia sinaptica nella ricerca e laboratori didattici.
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Articolo metodologico
Channelrhodopsin2 stimolazione mediata dei potenziali Synaptic a Drosophila Giunzioni neuromuscolari
In questo articolo
Sommario
Protocollo
Parte 1: la cura degli animali e croci genetica
- Mantenere UAS-ChR2 e OK371-GAL4 linee di volare in bottiglie separate contenenti supporti standard 8 volare.
- Raccogliere vergini di OK371-GAL4 linee volo ed i maschi di UAS-ChR2 linee.
- Mettere maschi e femmine in una fiala contenente dei media volare miscela standard con 1 mM tutto-trans retinico (ATR). ATR cibo dovrebbe essere presa da primo media volare fusione regolare in un forno a microonde per circa 1 minuto. Una volta sciolto, lasciare raffreddare per circa 30 secondi a un minuto e poi aggiungere 100 ml di 100 mM ATR in 100 ETOH% per ogni 10 ml ....
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Discussione
Passaggi critici coinvolgono sia la dissezione iniziale e l'ingresso delle cellule muscolari. Se i nervi vengono tagliati o muscolo viene danneggiato durante la dissezione iniziale è difficile continuare il resto della sperimentazione. Durante la dissezione, bisogna stare molto attenti a sezionare le forbici angolo verso l'alto il più possibile durante l'incisione dorsale. Durante il secondo passo fondamentale, entrando in una cellula muscolare, si deve guardare per un passato iperpolarizzazione ~ 30 mV. I v.......
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Dichiarazioni
Noi non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of concede Salute RO1GM-33205 e MH-067284-LC Griffith e da una borsa di studio estiva Brandeis di ricerca dell'Università di laurea a New Jersey Hornstein. Esperimenti preliminari per questa tecnica sono stati eseguiti presso il Marine Biological Laboratory come parte del 2008 e l'estate dei sistemi neurali corso Behavior (NIMH sovvenzione: R25 MH059472) in Woods Hole, Massachusetts.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| Puntine minutens | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| Piatto da dissezione | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Amplificatore intracellulare Neuroprobe e stadio frontale | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Sistema di acquisizione dati Powerlab 4/30 |  ADInstruments | www.adinstruments.com | |
| Stimolatore Grass | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| Computer desktop | Dell | www.dell.com | |
| Microscopio da dissezione | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| Sorgente luminosa | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| Mezzo per Drosophila | |||
| Retinale tutt-trans | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 Drosofile | Bloomington Stock center | ||
| UAS-ChR2 Drosofile | laboratorio Fiala, laboratorio Griffith | ||
| Circuito del controller LED | Costruito nel laboratorio Griffith | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composto da: 1. Buck Puck da 200 mA 2. LED blu 3. Filo isolato 4. Breadboard per circuiti | |
| Dissipatore di calore per LED | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| Tavolo antivibrazioni | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| Gabbia di Faraday | Costruita nel laboratorio Griffith | ||
| Micro-manipolatore Leica Leitz M | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| Portaelettrodi | Axon Instruments | www.axon.com | |
| Vetro borosilicato | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| Tiratore di elettrodi | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| Soluzione salina HL 3.1 con 0,8 mM Ca2+ | Composizione (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0,8 MgCl2:4 Saccarosio:115 NaHCO3: 10 Trehalosio: 5 HEPES | ||
| Strumenti per microdissezione | Fine Science Tools | www.finescience.com |
Riferimenti
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Dros....
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Ristampe e permessi
