Fabbricazione di miogenici Costrutti di ingegneria tessutale

Sommario

In questo studio dimostriamo realizzazione di costruzioni a base di collagene dei tessuti, contenenti mioblasti scheletrici. Questi costrutti ingegnerizzati in 3-D possono essere usati per sostituire o riparare i tessuti In vivo. Per i nostri scopi, abbiamo progettato questi come un canale atrioventricolare elettrico per la riparazione di blocco cardiaco completo ^[1].

Abstract

Nonostante il fatto che i pacemaker elettronici sono salvavita dispositivi medici, le loro prestazioni a lungo termine nei pazienti pediatrici può essere problematico a causa delle restrizioni imposte dalle ridotte dimensioni di un bambino e la loro crescita inevitabile. Di conseguenza, vi è una reale necessità di terapie innovative progettate specificamente per i pazienti pediatrici con disturbi del ritmo cardiaco. Proponiamo che una alternativa biologica conduttivo costituito da una matrice a base di collagene contenenti autologously cellule derivate potrebbe adattarsi meglio alla crescita, ridurre la necessità di interventi chirurgici ricorrenti, e migliorare notevolmente la qualità della vita per questi pazienti. Nel presente studio, si descrive una procedura per l'integrazione primaria mioblasti scheletrici colture di cellule in una matrice idrogel di moda un costrutto tessuto chirurgicamente impiantabili che servirà come un condotto elettrico tra le camere superiori e inferiori del cuore. In ultima analisi, possiamo anticipare utilizza questo tipo di ingegneria tessutale per ripristinare atrioventricolare di conduzione elettrica nei bambini con arresto cardiaco completo. In considerazione di questo, abbiamo isolare mioblasti dai muscoli scheletrici di ratti neonati Lewis e la piastra di loro su piatti tessuto laminina rivestite cultura utilizzando una versione modificata di protocolli stabiliti

Protocollo

Parte 1: Assemblare costruire stampi

1. Utilizzare una lama di rasoio di dimezzare tubi in silicone (VWR) e tagliarla in 3 pezzi cm di lunghezza.
2. Mettere una goccia di protesi in silicone RTV di qualità adesiva (Rhodia) all'interno di ciascuna estremità del tubo.
3. Rapidamente posto un piccolo pezzo (1 cm x 1 cm) di poliestere mesh (McMaster-Carr) sulla caduta di silicone e allinearlo con l'estremità del tubo. Questo presenta una superficie leggermente rialzato e piano per il fissaggio costruire. Ripetere l'operazione per l'altra estremità.
4. Lasciare lo stampo ad asciugare a temperatura ambiente per 3 giorni. E 'utile fare 20-30 stampi in un momento, in quanto questi sono essenzialmente usa e getta.
5. Una volta che l'adesivo è completamente asciutto, conservare questi stampi in un bicchiere pieno di etanolo al 70% fino a quando non sono necessari. Questa operazione aiuterà sterilizzare gli stampi e il prodotto finito è mostrata in Figura 1.

Parte 2: Preparazione per l'isolamento delle cellule mioblasti

1. Diluire 1 mg Laminina (Sigma) in 250 ml 0,22 micron, sterilizzata per filtrazione tampone fosfato salino (PBS) contenente 1% di penicillina / streptomicina (Invitrogen) e 1% Fungizone (Invitrogen).
2. Cappotto 150 millimetri di tessuto piastre di coltura (BD Falcon) con 4 mL di soluzione diluita Laminina dal punto 1.1 e incubare a 37 ° C per almeno 4 ore prima della placcatura primaria mioblasti scheletrici.
3. Fai il medium mioblasti mescolando F-10 Ham Miscela di nutrienti (Sigma) con 20% FBS (Atlanta Biologicals), 5 ng / L di base del fattore di crescita dei fibroblasti (Promega), 1% penicillina / streptomicina (Invitrogen), e 1% Fungizone ( Invitrogen).
4. Preparare la soluzione di digestione del muscolo scheletrico sciogliendo 1 g di ~ 295 U / mg Collagenasi 2 (Worthington) in 100 ml 2,4 U / mL dispasi-2 (Roche). Aggiungere 0,037 g di CaCl ₂ e mescolare bene. Filtro sterilizzare il buffer digestione utilizzando un disco di 0,2 micron filtro montato su una siringa da 10 ml e aliquote conservare a -20 ° C. Posizionare l'importo necessario per la digestione dei tessuti a 37 ° C insieme con i media mioblasti.

Parte 3: isolamento dei mioblasti di muscolo scheletrico

1. Con pinze e forbici piccole, rimuovere i muscoli paravertebrali da ratti neonati morti Lewis dal taglio lungo la schiena lungo il midollo spinale, togliendo la pelle e gli strati fascia e poi asportare i muscoli.
2. In una cappa colture di tessuti, i muscoli asportato posto in un tubo da 50 ml coniche (BD Falcon) riempito con 40 mL di soluzione 1X Salt Hanks bilanciata (HBSS) (Invitrogen) su ghiaccio. Lasciare le strisce muscolari di depositarsi sul fondo della provetta e rimuovere con attenzione la maggior parte dei residui liquidi e sangue da vuoto di aspirazione con una pipetta Pasteur sterile in una cappa cultura (Baker).
3. Versare i pezzi di muscolo raccolte su di un piatto di cultura 150 mm e rimuovere la maggior quantità di liquido residuo possibile con aspirazione. Utilizzando 2 singolo taglio lame di rasoio tritare il tessuto di una pasta spessa. Versare preriscaldata soluzione digestione sulla pasta e trasferire il composto per un nuovo tubo da 50 ml con una pipetta 10 ml. Durante la digestione enzimatica, il tessuto è occasionalmente triturato (senza bolle) con una pipetta 10 mL montata su un cordless Pipetta-Aid (Drummond). Ancora una volta, permette al tessuto di stabilirsi e di rimuovere il liquido in eccesso.
4. Posizionare il tubo su una piattaforma a dondolo e digerire a 37 º C per circa 30 min.
5. Una volta che il muscolo è liquefatto, filtrare la soluzione attraverso un colino cellula 70 micron (BD Falcon) e centrifugare a temperatura ambiente per 10 min a 600 xg (Beckman GP). Con una pipetta Pasteur e di aspirazione, rimuovere la maggior quantità di liquido possibile e risospendere il precipitato con 10 ml di medium mioblasti caldo.
6. Pre-piastra le cellule su una piastra di coltura non patinata 150 millimetri di tessuto per 15 minuti per contribuire a rimuovere fibroblasti.
7. Trasferire le cellule che non hanno ancora attaccato al laminina rivestite cultureware e diluire in modo che vi è una piastra per ogni 1 o 2 cuccioli di ratto. Porre la piastra in una serie incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO _2.

Parte 4: Casting costruzioni di ingegneria tessutale (5 ml)

1. Dopo 1 o 2 giorni, rimuovere 10 dei 150 lastre tessuto millimetri cultura mioblasti dal termostato, lavare due volte con 37 ° C 1X PBS e aggiungere 4 ml di caldo 0,05% tripsina-EDTA per ogni piatto. Ritorna le piastre per l'incubatore per 5 min.
2. Raccolto il mioblasti staccato dalle piastre nel cofano della cultura e raccogliere il liquido in un tubo da 50 ml (BD Falcon). Usare 10 ml di medium mioblasti a lavare tutti i piatti e combinare questo con le cellule in provetta da centrifuga. Agglomerare le cellule a temperatura ambiente per 10 min a 600 xg (Beckman GP) e rimuovere il liquido in eccesso come descritto al punto 3.5.
3. Risospendere le cellule mioblasti in 1,6 ml di terreno mioblasti e posto sul ghiaccio.
4. Utilizzando cautela il numero 4 stampini da costruire passo 1,5 e lavare due volte con PBS 1X. Aspirazione aspirare tutte le tracce di PBS con una pipetta Pasteur prima di effettuare ogni stampo in un 6-ben cu tessutolture piastra (BD Falcon).
5. Raccogliere le altri reagenti necessari per la preparazione di costruire (F10 Ham di 10X, gli antibiotici, il collagene di tipo 1 [3,9 mg / ml] ^[6] e Matrigel ™) su ghiaccio e tenere i media mioblasti a 37 ° C. Combina 500 microlitri 10X Ham F10, 100 ul penicillina / streptomicina, 100 microlitri Fungizone, 1,6 ml di collagene, e 750 ™ Matrigel microlitri in un tubo da 15 ml. Miscelare la soluzione per 10 secondi con un Mini-vortex (VWR) impostato su 10 e posto sul ghiaccio.
6. Successivamente, aggiungere 80 ml ​​di NaHCO ₃ e la sospensione mioblasti dal punto 3.3 a miscela dal punto 3.5. Vortice della miscela per 10 secondi e riportare il tubo al secchio del ghiaccio per un paio di minuti per eliminare la soluzione di bolle.
7. Accuratamente fusa il composto negli stampi prima che inizi a solidificare con una pipetta 10 ml. Ogni stampo terrà circa 1 ml di liquido viscoso. Cercate di evitare l'introduzione di bolle d'aria durante questa procedura.
8. Trasferire accuratamente l'piastra contenente i costrutti cast dell'incubatore. Dopo circa 30 minuti, togliere i costrutti solidificato dal termostato ed aggiungere con cautela medio mioblasti in ciascun pozzetto per coprire il tessuto costrutto. Riportare la piastra per l'incubatore (Figura 2).

Parte 5: risultati Rappresentante

Quando questo protocollo è eseguita correttamente, i mioblasti contenente costruire il tessuto è pronto per l'impianto in vivo (cioè quando viene rimosso dallo stampo) o per ulteriori analisi in vitro dopo 2 giorni.

Esempi Figura 1. Completato di costruire stampi (vedi punto 1.5).

Figura 2. Un solidificato mioblasti contenente tessuto costruire ^[1].

Figura 3. Sezioni H & E macchiato di un mioblasti contenente tessuto costruire. "A" rappresenta una sezione longitudinale e "B" mostra una sezione trasversale.

Discussione

Le forme in cui il costrutto tessuto sarà cast può essere effettuato in qualsiasi forma e dimensione, ma ci deve essere almeno due punti di attacco. In caso contrario, la matrice e le cellule formano una struttura sferica e le cellule muoiono. Nel presente protocollo, si descrive l'utilizzo di una maglia in poliestere per questo scopo, ma abbiamo anche utilizzato con successo in rete in acciaio inox. Ovviamente, più grandi stampi richiederà più celle e un volume maggiore di altri ingredienti. Quando si effettuano gl...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubazione in silicone	VWR international	60985-724
Adesivo in silicone	Rhodia Silicones	MED ADH 4300 RTV
Rete in poliestere	McMaster-Carr	93185T17
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
Miscela nutritiva F-10 HAM	Sigma-Aldrich	N6908
Serum fetale bovino	Atlanta Biologicals	S11550
Penicillina/Streptomicina	Invitrogen	15140
Fungizone	Invitrogen	15290-018
Dispasi-2	Roche Group	10295825001
Collagenasi 2	Worthington Biochemical	46H8863
Fattore di crescita dei fibroblasti di base	Promega Corp.	G5071
Piastre per colture cellulari da 150 mm	BD Biosciences	353025
Tripsina-EDTA 0,05% (1X)	GIBCO, by Life Technologies	25300
Soluzione salina equilibrata di Hanks 1X	Invitrogen	14170-112
NaHCO3 al 7,5%	GIBCO, by Life Technologies	25080-094
Filtro cellulare da 70 μm	BD Biosciences	352350
Piastre a 6 pozzetti	BD Biosciences	353046
Flacone conico da 50 mL	BD Biosciences	352098
Flacone conico da 15 mL	BD Biosciences	352099
Filtro da 0,2 μm	Nalge Nunc international	194-2520