$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Protocollo
Parte 1: Preparazione per la microiniezione
- Preparare l'iniezione tirando aghi capillare utilizzando Sutter estrattore ago Instruments.
- Riempire l'ago con un colorante fluorescente (come il Texas-Red destrano).
- Montare l'ago in un apparato micromanipolatore e microiniezione.
- Tagliare l'ago per la dimensione appropriata in un angolo per creare una punta smussata.
- Misurare la dimensione delle gocce e controllare che sia tra 1-2NL per iniezione d'olio.
Parte 2: Preparazione degli embrioni
- Iniettare gli embrioni 30 minuti prima rispetto alla fase di interesse. Ad esempio, per studiare i ventricoli a 24 ore dopo la fecondazione (HPF), iniettare gli embrioni a 23,5 HPF. Fase gli embrioni secondo Kimmel et al. (4).
- Con lo stereomicroscopio, rimuovere con attenzione il corion dagli embrioni utilizzando pinze.
- Utilizzando un piatto di plastica rivestito con 1% di agarosio, fare buchi nella agarosio con un puntale di plastica 100-200 microlitri. Rimuovere con cautela i tappi di agarosio dai fori con pinze.
- Trasferimento degli embrioni nei media embrione nel piatto agarosio con fori.
- Aggiungi tricaine (in conformità con le Westerfield (5)) ai mass media per anestetizzare gli embrioni ed evitare movimenti durante l'esperimento.
- Posizionare con delicatezza la coda dell'embrione giù nel buco, e orientare in modo che l'apparato di iniezione si trova sul lato posteriore dell'embrione.
Parte 3: Iniezione del ventricolo cerebrale
- Per iniettare il ventricolo del cervello, disporre l'installazione di micromanipolazione in modo che la punta dell'ago sia nello stesso campo di vista come l'embrione ad alta potenza.
- Accuratamente messo l'ago attraverso la roofplate sottile del romboencefalo appena posteriore al hingepoint r0/r1 senza colpire il tessuto cerebrale sottostante.
- Iniettare quel tanto che basta colorante per riempire completamente i ventricoli. Si può richiedere diverse iniezioni per riempire lo spazio ventricolo, a seconda della fase dell'embrione.
Parte 4: immagini
- Con un panno pulito 1% agarosio rivestite piatto, fare buchi nuovi nel piatto, togliere le spine, e aggiungere tricaine per anestetizzare gli embrioni e di impedire il movimento.
- Mettere la coda del ventricolo-embrione iniettato nel foro e la posizione di un'immagine dorsale.
- Scattare una foto a luce trasmessa.
- E 'molto critico il movimento, non l'embrione o il microscopio.
- Modificare le impostazioni del microscopio e scattare una foto con la luce fluorescente.
- Riposizionare l'embrione per ottenere immagini laterale sia con luce trasmessa e luce fluorescente.
- Salvare le immagini come file TIFF per l'elaborazione delle immagini in Photoshop.
Parte 5: Image Processing
- Per elaborare le immagini in Photoshop, aprire la luce trasmessa e luce fluorescente immagini dell'embrione stesso preso nella stessa posizione. Assicurarsi che tutte le impostazioni sono le stesse per ogni immagine.
- Trascina l'immagine fluorescente sull'immagine luce trasmessa e allinearli esattamente.
- Con l'immagine fluorescente selezionata, selezionare "Immagine", "Regolazioni" e poi "Sostituisci colore" e modificare lo sfondo nero al bianco.
- Nella "Sostituisci colore" finestra regolare il fattore di "confusione" a destra fino a quando le immagini fluorescenti appare di colore uniforme.
- Nella finestra "Livelli", selezionate "Multiply" per visualizzare le immagini sovrapposte. La tua immagine spazio ventricolo deve corrispondere l'immagine trasmessa luce esattamente.
- Salvare il file e ripetere per altre immagini.
Risultati rappresentante / Esito
Una corretta immagini iniezione ventricolo sono mostrati in figura 1 pannelli dC, mentre un esempio di immagini di iniezione non corretti sono riportati nella EH. Iniezioni corretto avere spigoli vivi e non diffusa colorante. Iniezione errato, che si verifica quando l'ago viene inserito troppo in là nel ventricolo e colpisce il tessuto cerebrale sottostante, può portare a colorante che è visibile al di fuori dello spazio ventricolo e nel tuorlo.
Figura 1. Ventricolo iniezioni di 25 embrioni hpf tipo selvatico. (AD) metodo di iniezione corretta e (EH) metodo di iniezione non corretti sono indicati come esempi. (A, E) le immagini brightfield dorsali con le corrispondenti immagini a fluorescenza (B, F) e la sovrapposizione delle immagini fluorescenti e campo chiaro (C, G) per i metodi di iniezione sia corrette e non corrette mostrato. Le frecce indicano le regioni in cui colorante è andato oltre lo spazio ventricolo del cervello a causa di un'iniezione ventricolo corretto (vedere "Risoluzione dei problemi"). Anteriore è a sinistra in tutte le immagini.
Risoluzione dei problemi:
| Problema | Rimedio |
| Sei schiacciamento l'embrione con l'ago. | L'ago è troppo ottuso o la punta è troppo grande. | Inizia con un nuovo ago e non rompere il più indietro. Smusso l'ago per renderlo tagliente come un ago della siringa. |
| Il colorante è in tutto l'embrione e il tuorlo (vedi Fig. 1E-H). | L'ago ha attraversato il tessuto e non stare nello spazio ventricolo. | L'ago potrebbe non essere abbastanza affilato, quindi non si riesce a controllare la velocità di foratura. |
| Il colorante è troppo debole o non nel proencefalo. | Non hai usato una pressione sufficientemente alta per l'iniezione, o l'ago non era abbastanza anteriore per raggiungere il proencefalo quando iniettato il colorante. | Aumentare la pressione di iniezione o di inserire il vostro ago leggermente più anteriore durante l'iniezione. È possibile inserire l'ago attraverso il mesencefalo romboencefalo confine se maggiori dettagli è necessario nel proencefalo. Si può anche semplicemente aspettare un po 'per la tintura di diffondere ulteriormente prima di imaging. |
| Le immagini fluorescenti sono scuri lungo i bordi dopo la sostituzione del colore in Photoshop. | Hai dimenticato di modificare l'impostazione "confusione" nella finestra di sostituire il colore. | Spostare la "confusione" tutta la strada a destra nella finestra di sostituire il colore. |
| L'ago non forare la roofplate rombencefalo. | L'ago non è tagliato in modo corretto. | Creare un nuovo ago. Se stai facendo un sacco di iniezioni potrebbe essere necessario aghi diversi come possono ottenere noiosa. |
Causa