Dopo la formazione del tubo neurale, il neuroepitelio restringe e le pieghe mentre il tubo si riempie di liquido cerebrospinale embrionale (eCSF) per formare i ventricoli del cervello embrionale. Abbiamo sviluppato questa tecnica ventricolo iniezione per visualizzare meglio lo spazio pieno di liquido in contrasto con la forma neuroepiteliale in un embrione vivo.
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Articolo metodologico
Zebrafish Cervello iniezione ventricolo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Corretta formazione ventricolo del cervello durante lo sviluppo embrionale del cervello è necessario per normali funzioni cerebrali. Ventricoli cerebrali sono cavità altamente conservati all'interno del cervello che sono pieni di liquido cerebrospinale. In zebrafish, dopo la formazione del tubo neurale, il neuroepitelio subisce una serie di costrizioni e pieghe mentre si riempie di liquido con conseguente formazione del cervello ventricolo. Al fine di comprendere il processo di formazione del ventricolo, e la forma cambia neuroepiteliale che si verificano allo stesso tempo, abbiamo bisogno di un modo per visualizzare la space ventricolo rispetto al tessuto cerebrale. Tuttavia, la natura di embrioni di zebrafish trasparente rende difficile distinguere il tessuto dallo spazio ventricolo. Pertanto, abbiamo sviluppato una tecnica di ventricolo cerebrale iniezione dove viene riempito lo spazio ventricolo con un colorante fluorescente e ripreso dal campo chiaro e microscopia a fluorescenza. Il campo chiaro e le immagini fluorescenti vengono poi elaborati e sovrapposti in Photoshop. Questa tecnica permette per la visualizzazione dello spazio ventricolo con il colorante fluorescente, rispetto alla forma del neuroepitelio nell'immagine campo chiaro. Ventricolo iniezione cervello in zebrafish può essere impiegato da 18 ore dopo la fecondazione ai primi stadi larvali. Abbiamo usato questa tecnica ampiamente nei nostri studi di formazione del cervello del ventricolo e la morfogenesi e nella caratterizzazione di mutanti morfogenesi del cervello (1-3).
Protocollo
Protocollo
Parte 1: Preparazione per la microiniezione
- Preparare l'iniezione tirando aghi capillare utilizzando Sutter estrattore ago Instruments.
- Riempire l'ago con un colorante fluorescente (come il Texas-Red destrano).
- Montare l'ago in un apparato micromanipolatore e microiniezione.
- Tagliare l'ago per la dimensione appropriata in un angolo per creare una punta smussata.
- Misurare la dimensione delle gocce e controllare che sia tra 1-2NL per iniezione d'olio.
Parte 2: Preparazione degli embrioni
- Iniettare gli embrioni 30 minut....
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Discussione
In questo video ci dimostra come iniettare colorante fluorescente (Texas-Red destrano) nello sviluppo di zebrafish ventricoli del cervello. Questo metodo viene utilizzato per visualizzare lo spazio ventricolo del cervello in contrasto con la neuroepitelio circostante ed è estremamente utile per determinare la forma dello spazio ventricolo così come la forma del tessuto cerebrale circostante. Ci permette di comprendere meglio il processo di formazione del cervello del ventricolo e la morfogenesi del cervello nel tempo l&.......
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Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Anna Laura Lowery che ha sviluppato questa tecnica in laboratorio. HS è supportato da NIHMH70926. Jennifer Gutzman è stato sostenuto dalla CSBI / Merck borsa di studio post-dottorato.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Pinzette | Strumento | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillari (puntine) | Strumenti | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Piastre rivestite con agarosio | Strumenti | Agarosio (Seakem GTG; Lonza) Piastre (Corning) | Agarosio (50027) Piastre (430166) | Preparare l'agarosio con uno spessore di circa 2-3 mm nella piastra, a seconda dello stadio dell'embrione da iniettare |
| Microscopio stereoscopico | Microscopio | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Telecamera per microscopio con capacità di fluorescenza e software per l'acquisizione delle immagini | Strumenti | |||
| Punte per pipetta da 1-200 μL | Strumenti | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | Sono della dimensione perfetta per praticare fori nell'agarosio e far sì che gli embrioni si adattino perfettamente. |
| Photoshop | Analisi delle immagini | Adobe | ||
| Loop per embrioni | Strumenti | Realizzarli autonomamente utilizzando una pipetta di vetro e un capello o un filo da pesca, sigillando con cera d'api. | ||
| Micoiniettore | Strumenti | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Tiratore di puntine | Strumenti | Sutter Instrument Co. | Impostazioni (Calore 785, Trazione 70, Velocità 40, Tempo 70). | |
| Micromanipolatore | Strumenti | Narishige International | ||
| Colorante fluorescente Texas-Red Destrano 70.000 MW | Reagente | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | Sono disponibili altri pesi molecolari, se desiderati. |
| Tricaina (ester etilico dell'acido 3-aminobenzoico) | Reagente | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Mezzo per embrioni | Reagente | Secondo Westerfield (5) |
Riferimenti
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafi....
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Ristampe e permessi
