Zebrafish Cervello iniezione ventricolo

Summary

Dopo la formazione del tubo neurale, il neuroepitelio restringe e le pieghe mentre il tubo si riempie di liquido cerebrospinale embrionale (eCSF) per formare i ventricoli del cervello embrionale. Abbiamo sviluppato questa tecnica ventricolo iniezione per visualizzare meglio lo spazio pieno di liquido in contrasto con la forma neuroepiteliale in un embrione vivo.

Abstract

Corretta formazione ventricolo del cervello durante lo sviluppo embrionale del cervello è necessario per normali funzioni cerebrali. Ventricoli cerebrali sono cavità altamente conservati all'interno del cervello che sono pieni di liquido cerebrospinale. In zebrafish, dopo la formazione del tubo neurale, il neuroepitelio subisce una serie di costrizioni e pieghe mentre si riempie di liquido con conseguente formazione del cervello ventricolo. Al fine di comprendere il processo di formazione del ventricolo, e la forma cambia neuroepiteliale che si verificano allo stesso tempo, abbiamo bisogno di un modo per visualizzare la space ventricolo rispetto al tessuto cerebrale. Tuttavia, la natura di embrioni di zebrafish trasparente rende difficile distinguere il tessuto dallo spazio ventricolo. Pertanto, abbiamo sviluppato una tecnica di ventricolo cerebrale iniezione dove viene riempito lo spazio ventricolo con un colorante fluorescente e ripreso dal campo chiaro e microscopia a fluorescenza. Il campo chiaro e le immagini fluorescenti vengono poi elaborati e sovrapposti in Photoshop. Questa tecnica permette per la visualizzazione dello spazio ventricolo con il colorante fluorescente, rispetto alla forma del neuroepitelio nell'immagine campo chiaro. Ventricolo iniezione cervello in zebrafish può essere impiegato da 18 ore dopo la fecondazione ai primi stadi larvali. Abbiamo usato questa tecnica ampiamente nei nostri studi di formazione del cervello del ventricolo e la morfogenesi e nella caratterizzazione di mutanti morfogenesi del cervello (1-3).

Protocol

Protocollo

Parte 1: Preparazione per la microiniezione

1. Preparare l'iniezione tirando aghi capillare utilizzando Sutter estrattore ago Instruments.
2. Riempire l'ago con un colorante fluorescente (come il Texas-Red destrano).
3. Montare l'ago in un apparato micromanipolatore e microiniezione.
4. Tagliare l'ago per la dimensione appropriata in un angolo per creare una punta smussata.
5. Misurare la dimensione delle gocce e controllare che sia tra 1-2NL per iniezione d'olio.

Parte 2: Preparazione degli embrioni

1. Iniettare gli embrioni 30 minuti prima rispetto all....

Discussion

In questo video ci dimostra come iniettare colorante fluorescente (Texas-Red destrano) nello sviluppo di zebrafish ventricoli del cervello. Questo metodo viene utilizzato per visualizzare lo spazio ventricolo del cervello in contrasto con la neuroepitelio circostante ed è estremamente utile per determinare la forma dello spazio ventricolo così come la forma del tessuto cerebrale circostante. Ci permette di comprendere meglio il processo di formazione del cervello del ventricolo e la morfogenesi del cervello nel tempo l&.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Strumento per pinze		Strumenti per scienze fini	11252-20
Tubi capillari (aghi)	Strumenti	Frederick Haer and Co.	30-30-1
Piatti rivestiti di agarosio	Strumenti	Agarosio (Seakem GTG; Lonza) Piatti (Corning)	Agarosio (50027) Piatti (430166)	Preparare l'agarosio a circa 2-3 mm di profondità nel piatto a seconda dello stadio dell'embrione che si sta iniettando
Microscopio da dissezione	Microscopio	Carl Zeiss, Inc.
Fotocamera per microscopio con funzionalità di fluorescenza e con software di acquisizione delle immagini	Strumenti
1-200 e punte per pipette	Strumenti	USA Scientific, Inc.	1111-0806	Questi sono della dimensione perfetta per fare i buchi nell'agarosio e far sì che gli embrioni si adattino perfettamente.
	Strumenti
Embryo Loop				Realizzali da solo con una pipetta di vetro e una lenza per capelli o lenza e sigillali con cera d'api.
Strumenti per microiniettori		Harvard Apparatus	PL1-100
Strumenti per estrattori ad ago		Sutter Instrument Co.		Impostazioni (Calore 785, Tiro 70, Velocità 40, Tempo 70).
Strumenti per	micromanipolatori	Narishige International
Colorante fluorescente Texas-Red Destrano 70.000MW	Reagente	Sonde molecolari, Life Technologies	D1830	Altri pesi molecolari sono disponibili se lo si desidera.
Tricaina (estere etilico dell'acido 3-aminobenzoico)	Reagente	Sigma-Aldrich	A-5040
Reagente			terreni embrionali	secondo Westerfield (5)