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Per lavorare in condizioni sterili, si raccomanda di eseguire tutti i passaggi in una cappa a flusso laminare.
1. Materiale
- HEPES tampone: 10 mm HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl 2)
- Collagenasi soluzione D: D Collagenasi: 100 mg / ml (Collagenasi D> 0,15 U / mg), in HEPES tampone
- DNasi I soluzione: 20.000 U / mL DNasi I
- Tampone PBS a pH 7,2
- PEB buffer: 1 parte di soluzione stock BSA in 20 parti autoMACS soluzione di risciacquo
- Tessuto: polmone derivati da 6 / 7 settimana di vita adulto femmina BALB / C del mouse, privo di organi adiacenti.
- Opzionale: microsfere CD11c, MACS Colonne MS, separatore MACS per l'isolamento di cellule dendritiche da polmone del mouse cella singola sospensione
2. Dissociare il tessuto polmonare
- Lavare il tessuto in una capsula di Petri contenente PBS per rimuovere eritrociti.
- Trasferire un massimo di 450 mg di tessuto polmonare stecca gentleMACS C contenente 4,9 ml di tampone HEPES.
- Aggiungere 100 ul soluzione Collagenasi D per una concentrazione finale di 2 mg / ml Collagenasi D.
- Aggiungere 10 L DNasi soluzione che ho fino a 150 mg di tessuto (concentrazione finale di 40 U / ml DNasi I) o 20 l DNasi I per 150-450 mg di tessuto polmonare (concentrazione finale di 80 U / mL DNasi I).
- Chiudere bene il tubo C e attaccarlo sul dissociatore gentleMACS. Quindi eseguire il programma "m_lung_01".
- Incubare per 30 minuti a 37 ° C con rotazione automatica o manuale trasformando ogni 5 minuti.
- Ritorno del campione al dissociatore gentleMACS ed eseguire il programma "m_lung_02".
3. Filtrazione
- Preparare una provetta da 50 ml per la raccolta di cellule filtrata sostituendo il tappo con un colino 70 celle mesh micron.
- Una volta che il secondo programma gentleMACS si conclude, a seconda della distribuzione di materiale campione nel tubo, si può centrifugare la provetta brevemente per raccogliere il materiale del campione sul fondo della provetta.
- Rimuovere le cellule attraverso il tappo sigillato setto della metropolitana C con una punta adatta 1000 microlitri pipetta e applicarli al filtro delle cellule.
- Lavare il filtro delle cellule con 5 ml di tampone HEPES a temperatura ambiente.
- Centrifugare le cellule a una pallina in un tubo da 50 ml a 300xg per 10 minuti.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule nel volume desiderato di tampone PEB.
Parte 4: Risultati Rappresentante:
Figura 1. Polmone dissociazione con l'™ gentleMACS dissociatore portato a 92% cellule vitali. Le cellule morte sono state fluorescenti colorate con ioduro di propidio (PI) (dot plot a destra; dot plot a sinistra: nessuna colorazione PI).
Figura 2. Dissociazione del tessuto polmonare del mouse utilizzando i risultati dissociatore gentleMACS in un'alta percentuale di leucociti vitali e cellule endoteliali. Il derivato cella singola sospensioni sono state colorate con CD45-PE e CD146-CD31-FITC o FITC e analizzate mediante citometria a flusso.
Figura 3. Singola cellula sospensioni derivate da tessuti polmonari del mouse era macchiata di CD11c-FITC e anti-mPDCA-1-APC per rilevare il mouse CD11c bassa m-PDCA-1 + DC plasmacitoidi così come le cellule CD11c alto.
Figura 4. Arricchimento delle cellule dendritiche con microsfere CD11c, un separatore MiniMACS e due colonne MS.