Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

Sommario

Descrizione di una procedura di fosforilazione quantitativa, utilizzando cryolysis, solubilziation urea, frazionamento HILIC e arricchimento IMAC di peptidi fosforilati.

Abstract

Questo protocollo descrive la crescita e la stimolazione, con l'oleato di acidi grassi, degli isotopi pesanti e leggeri cellule di S. cerevisiae. Le cellule sono a terra con un procedimento cryolysis in una smerigliatrice mulino a sfere e la conseguente grindate portato in soluzione mediante solubilizzazione urea. Questa procedura permette la lisi delle cellule in uno stato metabolicamente inattivo, conservando la fosforilazione e la prevenzione riorientamento della phosphoproteome durante la lisi cellulare. Dopo la riduzione, alchilazione, tripsina digestione delle proteine, i campioni sono dissalati su colonne C18 e la complessità del campione ridotto di frazionamento mediante cromatografia di interazione idrofilica (HILIC). Colonne HILIC preferenzialmente trattenere le molecole idrofile che ben si adatta per fosfoproteomica. Peptidi fosforilata tendono ad eluire successivamente nel profilo cromatografico che le controparti non fosforilata. Dopo frazionamento, fosfopeptidi sono arricchite usando la cromatografia in metallo immobilizzato, che si basa sulla carica a base di affinità per l'arricchimento fosfopeptide. Al termine di questa procedura i campioni sono pronti per essere analizzato quantitativamente mediante spettrometria di massa.

Protocollo

La crescita delle cellule e dei media

1. Una singola colonia di cellule BY4742Δarg4Δlys1 durante la notte in 100 ml di mezzi di comunicazione ricco di un OD ₆₀₀ di 1,0 allora seme in due culture, 1 litro di un mezzo di lievito minimo (0,17% lievito di base di azoto, senza solfato di ammonio o amminoacidi, solfato di ammonio 0,5%) contenente un gamma completa di aminoacidi, integrata con 20 mg / L di arginina isotopi normale o pesante ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _4; Isotec) e lisina ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _2; Isotec).
2. Le cellule sono state coltivate per 18 ore, ad un OD ....

Discussione

Questo metodo produrrà un arricchimento di fosfopeptidi che può essere analizzato quantitativamente. Un certo numero di parametri possono essere modificati in questo protocollo, ma l'aspetto più importante da ricordare è per preservare la vostra fosforilazione. Preparazione delle cellule per la quantificazione può essere ottenuto in molti modi diversi, ad esempio se non si possono etichettare le cellule in vivo, i tag come ICAT [3] o ITRAC [4] può essere utilizzato estrazione messaggio per etichettare in mo.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Isotec™ L-Arginina-13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-Lisina-15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) 7,4 (10X) liquida	Invitrogen	70011044
Compresse SigmaFAST Inibitore di Proteasi	Sigma-Aldrich	S8820
Cocktail Inibitore di Fosfatasi Pierce Halt	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
Macinatore a palle Retsch PM100	Retsch	20.540.0001
Vaso di macinazione in acciaio inossidabile Retsch da 125 ml	Retsch	01.462.0148
Colonna Ultramicrospin C18	The Nest Group	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
Colonna analitica TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm	Tosoh Corp.	13071	Questa è la colonna cromatografica HILIC.
Colonna di protezione 4,6 mm di diametro interno x 1 cm	Tosoh Corp.	19021	Si raccomanda questa colonna di protezione per prolungare la vita della colonna HILIC.
Gel di affinità per ferro PHOS-Select™	Sigma-Aldrich	P9740	Questa è la resina IMAC. Aliquotare e conservare.