Articolo metodologico

Isolamento di cellule della cavità peritoneale mouse

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DOI:

10.3791/1488

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28 gennaio 2010

 , 
1BloodCenter of Wisconsin, Blood Research Institute

In questo articolo

Sommario

La cavità peritoneale nei mammiferi contiene diverse popolazioni di cellule immunitarie cruciali per risposte immunitarie innate. Un metodo efficiente isolamento è necessario per le analisi biochimiche e funzionali di queste cellule. Qui forniamo un metodo completo per l'isolamento di cellule cavità peritoneale nel topo.

Abstract

La cavità peritoneale è una cavità legata alla membrana e piene di liquido addominale di mammiferi, che contiene il fegato, nella milza, la maggior parte del tratto gastro-intestinale e altre viscere. Si porti un certo numero di cellule immunitarie tra cui i macrofagi, le cellule B e le cellule T. La presenza di un elevato numero di macrofagi ingenuo nella cavità peritoneale rende un luogo preferito per la raccolta dei macrofagi residenti ingenuo dei tessuti (1). La cavità peritoneale è importante anche per lo studio delle cellule B a causa della presenza di un unico cavità peritoneale residenti sottoinsieme B cellule conosciute come cellule B1, oltre alle cellule B2 convenzionali. Celle B1 sono suddivise in celle B1a e B1b, che si distingue per l'espressione di superficie di CD11b e CD5. Celle B1 sono una fonte importante di IgM fisiche che forniscono protezione precoce da una varietà di agenti patogeni (2-4). Queste cellule sono autoreattivi in ​​natura (5), ma come vengono controllati per evitare che l'autoimmunità non è ancora compresa del tutto. Al contrario, CD5

Protocollo

  1. Prima di avviare il processo, i seguenti elementi devono essere raccolte e preparate per:
    • Ghiaccio
    • Siringa da 5 ml con ago 27g
    • Siringa da 5 ml con ago 25g
    • Blocco di polistirolo e perni per il montaggio del mouse
    • Vassoio sul quale il blocco di montaggio può essere posizionato
    • Forbici e pinze
    • Raccolta tubi
    • Etanolo al 70%
    • PBS con il 3% di siero fetale bovino (FCS) (Pre refrigerati e tenuta in ghiaccio)
  2. Euthanize il mouse, spruzzare con il 70% di etanolo e montarlo sul blocco di polistirolo sulla sua schiena.
  3. Utilizzando un paio di forbici e pinze tagliare la pelle esterna del peritoneo e delicatamente tirare indietro per esporre la pelle interna che riveste la cavità peritoneale.
  4. Iniettare 5 ml di PBS freddo ghiaccio (con il 3% FCS) nella cavità peritoneale con un ago 27g. Spingere l'ago lentamente nel peritoneo facendo attenzione a non forare qualsiasi organi.
  5. Dopo l'iniezione, massaggiare delicatamente il peritoneo per rimuovere tutte le cellule attaccato nella soluzione PBS.
  6. Inserire un ago da 25 g, smusso fino, attaccato ad una siringa da 5 ml nel peritoneo e raccogliere il liquido mentre si muove la punta dell'ago delicatamente per evitare di intasare dal tessuto adiposo o di altri organi. Raccogliere quanto più possibile fluido e depositare la sospensione cellulare raccolti in provette tenuta in ghiaccio dopo aver rimosso l'ago dalla siringa.
    Opzionale: Ripetere il punto 4-6
  7. Fare un'incisione nella pelle interna del peritoneo e tenendo la pelle con una pinza usare una pipetta Pasteur di plastica per raccogliere il liquido rimanente dalla cavità.
  8. Se al punto 6 o 7 contaminazione del sangue visibile viene rilevato poi il campione contaminato deve essere eliminato.
  9. Gira la sospensione cellulare raccolti a 1500 RPM per 8 minuti, scartare il sopranatante e risospendere le cellule nel supporto desiderato o PBS per il conteggio.

Protocollo alternativo di ottenere Thioglycollate suscitato macrofagi:

Questo metodo è utilizzato per ottenere una maggiore resa dei macrofagi.

  1. Iniettare 5 ml di 3% (w / v) Brewer Thioglycollate media (7) nella cavità peritoneale di ogni topo.
  2. Attendere 3-5 giorni, e passare al punto 1 di cui sopra per la raccolta delle cellule.

Rispetto all'approccio nonelicited, circa 10 volte più macrofagi possono essere raccolti. L'unica preoccupazione è che i macrofagi ottenuti da questa procedura si differenziano per alcune delle loro proprietà fisiologiche.

Rappresentante dei risultati:

Da un mouse non manipolata, 5-10 milioni di cellule cavità peritoneale può essere ottenuto con un protocollo di buon isolamento. Fra tutte le cellule vive, il 50-60% sono cellule B, macrofagi ~ 30% e 5-10% sono cellule T (Fig. 1).

figure-protocol-1
Figura 1. Fenotipo delle cellule isolate dalla cavità peritoneale. Isolamento seguito delle cellule cavità peritoneale sono stati colorati con anti-topo TCRβ-FITC, B220-PE-Texas rosso-blu del Pacifico CD11b, CD23-PE-Cy7 e CD5-APC. Trame rappresentante citometria di flusso mostrano percentuali di cellule B e T (a), macrofagi (b), B1 e B2 cellule (c) e le cellule B1a e B1b (d).

Discussione

Isolamento di cellule cavità peritoneale è una tecnica importante per lo studio delle diverse cellule del sistema immunitario, principalmente i macrofagi e specifici sottoinsiemi delle cellule B. Anche se questo è un processo semplice, ci sono alcuni passaggi critici coinvolti. Presenza di contaminanti nel sangue raccolto il campione deve essere evitato per ottenere una pura cavità peritoneale popolazione di cellule. Eutanasia per dislocazione cervicale dovrebbe essere fatto con attenzione per evitare la contaminazione del sangue nella cavità peritoneale. In alternativa CO 2 può essere utilizzato. Inoltre, durante la cura corretta procedura da adottare per evitare la puntura della vescica o degli altri organi nella cavità peritoneale. Recuperare la maggior parte del liquido iniettato è importante anche per il rendimento della cella.

Questa procedura è ampiamente utilizzato per studiare la biologia dei macrofagi dal numero moderato di residenti, i macrofagi non stimolate possono essere facilmente ottenuto dalla cavità peritoneale, in contrasto con il laborioso compito di differenziazione delle cellule progenitrici mieloidi in macrofagi maturi in vitro, utilizzando fattore stimolante le colonie di macrofagi (8 , 9). La resa dei macrofagi dalla cavità peritoneale può essere migliorata utilizzando il metodo di elicitazione Thioglycollate, anche se l'uso Thioglycollate potrebbero alterare le proprietà fisiologiche dei macrofagi (7).

Cellule B sono una parte importante del nostro sistema immunitario giocare un ruolo cruciale sia l'immunità innata e adattativa. Tra le diverse sottopopolazioni di linfociti B, cellule B1 costituiscono un particolare sottogruppo di cellule B coinvolte nell'immunità innata, autoimmunità e regolazione del sistema immunitario. Celle B1 sono principalmente situati nella cavità peritoneale e rifornimento di auto. Si tratta di uno dei produttori primari di IgM naturali che fornisce la prima linea di protezione contro un certo numero di virus e batteri (10-12). Celle B1 sono anche una fonte importante di IL-10 (6), che è una citochina importante coinvolte nella regolazione del sistema immunitario. Anche se diversi studi sono stati perseguiti con le cellule B1, c'è ancora spazio per un'ulteriore valutazione delle loro funzioni contrastanti, specialmente il loro ruolo regolatore. Cavità peritoneale di cellule metodo isolamento offre l'opportunità unica di studiare le funzioni delle cellule B1.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH concedere AI069358 e la Fondazione di Ricerca BloodCenter.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Mezzo tioglicollato, modificato secondo BrewerBD Biosciences211716

Riferimenti

  1. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
  2. Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
  3. Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
  4. Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
  5. Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
  6. O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
  7. Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
  8. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
  10. Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
  11. Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
  12. Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).

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