Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Sommario

Qui mostriamo i protocolli per l'esecuzione di singola molecola microscopia a fluorescenza a vivere cellule batteriche per permettere funzionali complessi molecolari per essere rilevati, monitorati e quantificati.

Abstract

Visione completa dei meccanismi delle cellule viventi può essere raggiunto solo attraverso lo studio dei processi chiave che suscitare e dirigere gli eventi a livello cellulare. Fino ad oggi la complessità dei sistemi biologici taglio ha causato preciso singola molecola sperimentazione di essere troppo esigente, concentrandosi invece su studi di singoli sistemi con massa relativamente greggio insieme alla media delle misurazioni. Tuttavia, molti processi importanti si verificano nella cellula vivente a livello di solo uno o poche molecole; misure ensemble generalmente mascherare la natura stocastica ed eterogenea di questi eventi. Qui, utilizzando avanzate di microscopia ottica e strumenti di analisi di analisi delle immagini ci mostrano come monitorare le proteine ​​all'interno della cellula batterica vivente solo con una precisione di singole molecole e come possiamo osservare la dinamica all'interno di complessi molecolari del funzionamento macchine biologiche. Le tecniche sono direttamente rilevanti fisiologicamente. Si tratta di mini-perturbativa e non-invasivo per il campione biologico oggetto di studio e sono completamente in sintonia per le indagini in materia viva, caratteristiche non facilmente disponibili ad altri approcci singola molecola di biofisica. Inoltre, i campioni biologici studiati tutti i prodotti proteina fluorescente-tag a livelli che sono quasi identici ai ceppi cellulari non modificato ("codifica genomica"), in contrasto con l'approccio più comune ma meno ideale per la produzione di proteine ​​molto più di quanto avverrebbe naturalmente ('plasmide di espressione'). Così, i campioni biologici reali, che saranno oggetto di indagine sono molto più vicini al organismi naturali, e quindi le osservazioni più rilevanti per le reali processi fisiologici.

Protocollo

1. Per iniziare questa procedura, 50 ml di scorte congelate della proteina fluorescente che esprimono Escherichia coli cellule batteriche vengono prima scongelate e coltivate aerobicamente con agitazione in 5 ml di LB mezzi di crescita durante la notte a 37 ° C. Al mattino, 50 ml di questa cultura satura viene estratto e sub-coltura in mezzi di glucosio minima M63 cultura, incubando a 30 gradi C per 4 a 6 ore. Qui mostriamo che utilizza due differenti ceppi cellulari, uno dei quali esprime un elettrone-trasporto citocromo fuso con GFP, l'altra che esprime una proteina coinvolta nel motore flagellare batterico fuso a GFP.
2. Le cellule possono sia raccolto direttamen....

Discussione

Bisogna fare attenzione a non "oltre al taglio" delle cellule per guardare i batteri legati, poiché questo può compromettere la funzionalità del motore flagellare. E 'importante utilizzare le cellule per molto più tempo di un'ora una volta sul vetrino da microscopio in quanto possono diventare ossigeno scarica. Notevole ottimizzazione può essere richiesto di trovare migliori condizioni di imaging microscopio soddisfatti al vostro specifico sistema biologico sotto inchiesta. Potrebbe essere saggio tenta.......