Si descrivono le modalità dettagliate per la trasfezione efficiente di DNA plasmidico nelle fibre dei muscoli piedi di topi dal vivo utilizzando elettroporazione e la successiva visualizzazione di espressione della proteina usando la microscopia a fluorescenza.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Transfection DNA dei mammiferi muscoli scheletrici con In Vivo Elettroporazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un crescente interesse per la biologia delle cellule è quello di esprimere forme transgenically modificato di proteine essenziali (ad esempio, costruisce fluorescente tag e / o varianti mutanti) al fine di indagare la loro distribuzione endogene e rilevanza funzionale. Un approccio interessante che è stato implementato per soddisfare questo obiettivo in cellule altamente differenziate è il
Protocollo
Le procedure sperimentali per elettroporazione in vivo dei muscoli FDB e IO
- Prima di avviare il protocollo di elettroporazione in vivo, i plasmidi di espressione mammifero deve essere amplificato per produrre la concentrazione nel range di 2-5 mg al Nota plasmide / l di TE:. Rotazione abbiamo utilizzare i kit di amplificazione commerciale e seguire le procedure del produttore '. Plasmidi di espressione commerciale portando il lavoro di promotore CMV, molto bene nel muscolo scheletrico in trasfezioni vivo.
- Aliquota il volume necessario (10-20 mL) della soluzione di plasmide e salvarlo in due provett....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Descriviamo qui la procedura dettagliata da seguire per raggiungere trasfezioni efficace di plasmidi DNA in fibre muscolari scheletriche di elettroporazione in vivo. I principali vantaggi del nostro approccio sono la semplicità di implementazione, e la sua minima invasività che si traduce in rischio per la salute trascurabile per gli animali. In realtà, i protocolli sopra descritti elettroporazione non implicano molto di più di due iniezioni sottocutanee per piede, seguito da un protocollo di stimolazione elett.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. T. Otis, Dipartimento di Neurobiologia, UCLA, per condividere l'impianto TPLSM con noi, il Dr. C. Fahlke, Istituto di Fisiologia, RWTH Aachen, in Germania, per la donazione del tipo pEYFP-ClC1 plasmide, e il signor . R. Serrano per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti NIH / NIAMS concede AR047664 e AR54816.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Riferimenti
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
