Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da fibroblasti umani Riprogrammare con il Stemgent Lentivirus umani TF Set

Summary

Dimostriamo il protocollo per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule somatiche umane utilizzando lentivirus-mediata consegna dei fattori umani Oct4, Sox2, Nanog, e Lin28. Pluripotenza è stata confermata dalla morfologia e la presenza di staminali embrionali (ES) cellulo-specifici marcatori.

Abstract

Nel 2006 Yamanaka e colleghi hanno dimostrato che i retrovirus-mediata consegna ed espressione di Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4 è in grado di indurre lo stato pluripotente in fibroblasti di topo. ¹ Lo stesso gruppo ha anche riferito del successo riprogrammazione di cellule somatiche umane in staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule umane usando versioni dei fattori di trascrizione stessa forniti da vettori retrovirali. ² Inoltre, James Thomson et al. riferito che il lentivirus-mediata co-espressione di un altro insieme di fattori (Oct4, Sox2, e Nanog Lin28 ) è stato in grado di riprogrammare cellule somatiche umane in cellule iPS ^3.

cellule iPS sono simili alle cellule staminali embrionali nella morfologia, la proliferazione e la capacità di differenziarsi in tutti i tipi di tessuto del corpo. Cellule umane iPS hanno un netto vantaggio rispetto cellule ES in quanto mostrano proprietà fondamentali delle cellule ES senza il dilemma etico della distruzione degli embrioni. La generazione di paziente-specifiche cellule iPS eludere un posto di blocco importante di terapie personalizzate medicina rigenerativa, eliminando il rischio di rigetto immunitario delle cellule trapiantate non autologo.

Qui mostriamo il protocollo per la riprogrammazione delle cellule di fibroblasti umani utilizzando il Stemgent umani Set Lentivirus TF. Mostriamo anche che le cellule riprogrammate con questa serie iniziano a mostrare iPS morfologia quattro giorni dopo la trasduzione. Utilizzando il Stemolecule Y27632, abbiamo selezionato per le cellule iPS e osservato corretta morfologia dopo tre round di colonia picking e passaging. Abbiamo anche dimostrato che, dopo la riprogrammazione delle cellule visualizzata la pluripotenza marcatore AP, marcatori di superficie TRA-1-81, TRA-1-60, SSE-4, e SSE-3, e marcatori nucleari Oct4, Sox2 e Nanog.

Protocol

1. Riprogrammazione

1. BJ cellule seme ad una densità di 1 x 10 ⁵ cellule per pozzetto di un 6-pozzetti. Coltivare le cellule in 2 ml di mezzo di crescita (450 ml Emem integrata con 50 ml di FBS ES qualificati, 5 ml di 10 mM di aminoacidi non essenziali, 5 ml di penicillina / streptomicina, 5 ml di 200 mM di L-glutamina e 0,9 ml di 55 mM β -mercaptoetanolo) overnight a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Lo stesso giorno, iniziare a preparare piatti alimentatore MEF con l'aggiunta di 0,1% di gelatina diluita in acqua per un piatto ben 6 e incubazione overnight a 37 ° C e CO 5% _2.
3. Dopo l'incubazione, rimuovere media dalle cellule BJ e aggiungere 2 ml di terreno di coltura integrata con 6 mg / ml di polibrene, 500 microlitri hOct4-lentivirus, 50 microlitri hSox2-lentivirus, 50 microlitri hNanog-lentivirus e 50 microlitri hLin28-lentivirus in ciascun pozzetto . Agitare delicatamente la piastra per assicurare uno strato uniforme del mezzo. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO _2.
4. Lo stesso giorno, togliere 1 fiala di CF-1 le cellule MEF da azoto liquido e disgelo. Rimuovere il liquido dai pozzetti rivestiti di gelatina (vedi punto 1.2) e aggiungere le cellule MEF alimentatore ad una densità di 0,2 x 10 ⁵ cellule / pozzetto. Il volume totale per bene dovrebbe essere 2 ml di cellule in terreno di crescita MEF (450 ml di DMEM integrato con 50 FBS ml e 5 ml di aminoacidi non essenziali).
5. Il giorno dopo, staccare le cellule BJ con il 0,05% tripsina / EDTA e centrifugare a 200 xg per 5 minuti. Aspirare il terreno e risospendere in mezzo di crescita. Togliere dalla piastra medio alimentatore MEF (vedi punto 1.4) e aggiungere 2 ml / pozzetto della sospensione cellulare BJ. La concentrazione di cellule dovrebbe essere di circa 5 x 10 ⁴ cellule / pozzetto. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO _2.
6. Sostituire media 24 ore dopo la risemina con umane ES / IPS mezzo di coltura cellulare (400 ml DMEM/F12 integrato con 100 ml di sostituzione Knockout siero, 5 ml di 10 mM di aminoacidi non essenziali, 5 ml di 200 mM L-glutammina, 0,9 ml 55 mM β-mercaptoetanolo e 20 ng / ml bFGF umano ricombinante). Cambia media ogni 24 ore per 7 giorni.
7. Dopo sette giorni, cambio medio a medio MEF condizionata (vedi punto 2).

2. Preparazione del mezzo MEF condizionata

1. Seme CF-1 le cellule MEF alimentatore con 2 x 10 ⁵ cellule / pozzetto su un piatto ben 6 in 2 ml di mezzo di crescita MEF. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Cambia medio umane ES / IPS mezzo di coltura cellulare. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO _2.
3. Raccogliere il supernatante ogni 24 ore per quattro giorni. Filtrare il surnatante attraverso un filtro a 0,22 micron.
4. Supplemento surnatante con 50 ng / ml di bFGF.

3. iPS selezione Colony e Passaging

1. Selezionare un ES-come colonia e ri-seme umano ES / IPS mezzo di coltura integrata con 10 mM di Stemolecule Y27632 sui piatti di coltura cellulare pre-seminati con cellule MEF CF-1 alimentatore. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Cambiare la cultura media ogni 24 ore per i primi sette giorni (senza l'integrazione con Stemolecule Y27632). Dopo sette giorni, cambio medio a medio MEF condizionata (vedi sezione 2 per la preparazione). Abbiamo continuato passaging le cellule fino a quando non hanno mostrato tipica morfologia umana ES.

4. Esame immunocitochimica di marcatori pluripotenza

1. Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS.
2. Fissare le cellule con 500 ml di fissativo per 20 minuti a temperatura ambiente.
3. Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS.
4. Blocca legame non specifico con 500 microlitri di buffer bloccando per un'ora a temperatura ambiente.
5. Incubare le cellule con 250 microlitri di anticorpo specifico primario overnight a 4 ° C (abbiamo usato TRA-1-81, TRA-1-60, SSE-4, SSE-3, Oct4, Sox2, e Nanog Lin28 a 1:100 diluizioni).
6. Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS.
7. Incubare le cellule con 250 microlitri di anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente, mantenendo al riparo dalla luce (abbiamo usato capra anti-topo coniugato IgM Cy3, capra anti-topo IgG Cy3 coniugato, capra anti-topo coniugato IgM Cy3 e di capra anti- Cy3 coniglio coniugato a diluizioni 1:300).
8. Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS.
9. Aggiungi DAPI (concentrazione finale 1 mg / ml) per l'ultimo lavaggio e incubare 5 minuti per visualizzare nuclei.
10. Analizzare le cellule sotto ingrandimento.

Parte 5: Risultati Rappresentante

1. Morfologia dei risultati:

Prepuzio fibroblasti umani (BJ), le cellule sono state co-trasdotte con Oct4, Sox2, Nanog, e Lin28. Cambiamenti morfologici sono stati osservati già dal 4 ° giorno post-trasduzione, e il cluster di cellule è diventato più fitto al giorno 17 (Figura 1). Colonie sono state raccolte manualmente al giorno 25 e coltivati ​​su cellule CF-1 alimentatore MEF. Per facilitare la formazione delle cellule iPS colonia dopo la riprogrammazione, abbiamo usato Stemolecule Y27632, Un inibitore ROCK, per la semina iniziale durante la notte durante ogni passaggio. colonie di cellule iPS con buona morfologia sono stati osservati dopo tre gare in sequenza di colonia picking e passaging.

2. Espressione di marcatori pluripotenza:

Per caratterizzare ulteriormente le colonie isolate cellule iPS, abbiamo cercato la presenza di marcatori di pluripotenza comuni espressi nelle cellule ES. Le colonie esposte forte fosfatasi alcalina (AP) attività (Figura 2). Inoltre, immunocitochimica (ICC) è stata effettuata su colonie di cellule iPS la con un pannello di anticorpi specifici marker pluripotenza, tra cui marcatori di superficie TRA-1-81, TRA-1-60, SSE-4 e SSE-3 così come marcatori nucleari Oct4, Sox2 e Nanog. Le colonie isolate iPS sono stati positivi per tutti gli indicatori (Figura 3). I risultati ICC mostrano che le cellule iPS esposto l'appropriato marcatore di pluripotenza pattern di espressione, a dimostrazione che queste cellule iPS assomigliano molto indifferenziate cellule staminali embrionali umane.

Figura 1: i cambiamenti morfologici delle cellule trasdotte BJ. Immagini in campo chiaro di una tipica colonia di cellule iPS formata in (A) 4 giorni e (B) 17 giorni dopo trasduzione.

Figura 2: attività di AP riprogrammato cellule BJ. Tre diverse colonie colorate con Stemgent Kit di colorazione fosfatasi alcalina.

Figura 3: le cellule umane iPS esprimono alti livelli dei marker delle cellule staminali seguenti specifiche: marcatori di superficie TRA-1-81, TRA-1-60, SSE-4 e SSE-3, e marcatori nucleari 4 ottobre, Sox2 e Nanog.

Discussion

Questi risultati dimostrano che la Stemgent umani Set Lentivirus TF può essere usato per generare in modo efficiente le colonie iPS inducendo l'espressione ectopica di trasduzione fattori di trascrizione in fibroblasti umani. Nel progettare gli esperimenti di riprogrammazione, diverse variabili dovrebbero essere considerate per ottimizzare l'efficienza della riprogrammazione. In primo luogo, il virus attivo rispetto al traguardo rapporto (molteplicità di infezione MOI) può avere bisogno di essere modificati durante la fase di trasduzione primario di raggiungere la massima efficienza di trasduzione. In secondo luogo, la condizione di crescita delle cellule bersaglio può avere un impatto riprogrammazione. Cellule sane e proliferativi sono più suscettibili di riprogrammazione. In terzo luogo, quando si modifica il protocollo per numero di cellule differenti, si raccomanda che il numero di cellule bersaglio essere adeguato in proporzione alla superficie del piatto cultura. Infine, gli inibitori ROCK applicando come Y27632 deve essere considerato per garantire la riprogrammazione di successo come studi recenti hanno dimostrato la propria utilità nel migliorare la sopravvivenza colonia hES. ^4,5

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Set di lentivirus TF umano	Stemgent	00-0005
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
TRA-1-81 anticorpo	Stemgent	09-0012
TRA-1-60 anticorpo	Stemgent	09-0009
Anticorpo SSEA-4	Stemgent	09-0003
Anticorpo SSEA-3	Stemgent	09-0014